[发明专利]用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗流感药物的筛选，更具体涉及流感病毒M2离子通道的荧光细胞模型及利用该细胞模型筛选M2离子通道阻断剂的方法。

背景技术

流感是由流行性感冒病毒引起的严重危害人类健康的一种急性病毒性呼吸道传染病。M2离子通道蛋白分布于流感病毒表面，是由97氨基酸组成的跨膜蛋白，四个M2离子通道蛋白单体通过二硫键和疏水作用形成四聚体，并构成一个离子通道，是抗流感药物的重要靶标。阻断M2离子通道的功能可以有效地抑制病毒感染细胞和复制，阻断病毒感染的扩散。目前临床上使用的M2离子通道阻断剂金刚胺和金刚乙胺在治疗流感中发挥了重要作用，但流感病毒对金刚胺和金刚乙胺产生了严重的抗药性。有必要建立新的M2离子通道阻断剂筛选模型，从化合物库中随机筛选，发现新的M2离子通道阻断剂，特别是发现对金刚烷胺耐药型M2离子通道有效的新阻断剂。

目前筛选抗流感药物方法包括体外实验和体内实验，体外实验有病毒抑制实验和噬斑实验：病毒抑制试验是利用化合物抑制病毒感染或复制，进而保护细胞，通过检测细胞活力达到筛选抗流感药物的目的；噬斑实验也是利用化合物抑制病毒感染或复制保护细胞，但通过检测噬斑数来筛选药物。体外实验即动物实验，以小鼠，雪貂等为对象，对动物给药后检测化合物是否具有保护作用。这些实验方法难以进行高通量筛选，且靶标不明，动物实验的成本又高，影响因素多。

M2作为离子通道，其高通量筛选方法的建立还有一定难度：首先由于M2离子通道在细胞上表达时对细胞有毒性作用，建立M2离子通道的模型困难；而且现有的离子通道研究方法有限，如电生理(膜片钳)，配体结合，离子流量测定等，而利用这些方法实现高通量还有一定难度。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型。同时，本发明还提供了利用该细胞模型筛选流感病毒M2离子通道阻断剂的方法。

本发明的用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型是含pH敏感的荧光物质的细胞。

优选的，所述的荧光物质为荧光指示剂或荧光蛋白。

优选的，所述的荧光指示剂包括荧光探针SNARF(seminaphthorhodafluors)、荧光探针SNARF-AM、8-羟基-1，3，6-三磺酸芘(HPTS，pyranine)、荧光素Fluoresceins、羧基荧光素carboxyfluoresceins、1，2，7-双-(羧乙基)-羧基-荧光素(BCECF)、双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM)。

优选的，所述的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白或荧光蛋白pHluorin。

优选的，所述的所述的绿色荧光蛋白包括含有S65T突变的绿色荧光蛋白突变体。

优选的，所述的含有S65T突变的绿色荧光蛋白包括S65T绿色荧光蛋白突变体、增强型绿色荧光蛋白、F64L/S65T/T203Y/L231H绿色荧光蛋白突变体或C48S/S65T/H148C/T203C绿色荧光蛋白突变体。

本发明提供的M2离子通道阻断剂筛选的细胞模型，是指将pH敏感的荧光指示剂和荧光蛋白标记M2表达细胞，标记方法：一是将荧光指示剂微量注射入细胞内；二是荧光指示剂与细胞一起孵育，脂溶性的荧光指示剂如BCECF-AM等通过细胞膜进入细胞内；三是利用M2离子通道和荧光蛋白表达载体(如pEGFP-C1)共转染细胞，建立M2离子通道与荧光蛋白共表达的稳定细胞。

上述的细胞模型在流感病毒M2离子通道阻断剂筛选中的应用方法是测定在酸性缓冲液条件下所述细胞模型中荧光值的变化。优选的，酸性条件为pH值低于6.2的条件。

在低于pH6.2的酸性环境中M2离子通道打开，细胞外的H+通过M2离子通道迅速内流，导致细胞内pH下降，pH的变化引起荧光值的改变。如果存在M2离子通道阻断剂，在酸性环境中H+的内流收到抑制，细胞内pH下降减慢。通过检测细胞荧光值，反映M2离子通道的抑制情况，从而反映M2离子通道阻断剂的活性。

本发明中所用的pEGFP-C1表达质粒为Clontech公司的商业化产品，BCECF-AM为Invitrogen公司的商业化产品。