[发明专利]一种碱性橙Ⅱ完全抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种碱性橙II完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

碱性橙II，英文名：Basic Orange II，CAS：532-82-1，化学名为4-苯基偶氮-1，3-苯二胺盐酸盐，又名橘红，柯衣定G，“王金黄”、“块黄”是俗名。性质：闪光棕红色结晶或砂块，溶于水呈黄光橙色，溶于酒精和溶纤素，微溶于丙酮，不溶于苯；遇浓硫酸呈黄色，稀释后呈橙色；遇硝酸呈橙色。碱性橙II是一种偶氮类碱性染料，为致癌物，禁止作为食品添加剂使用，主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色。根据美国卫生研究所(NIH)化学品健康与安全数据库资料表明：过量摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性或慢性的中毒伤害。可能添加的食品类别为腐皮。现有的仪器检测法很难实现对其免疫检测，尚无其免疫检测方法的报道。为了弥补这一空白，设计了以碱性橙II为半抗原的合成免疫检测用的碱性橙II完全抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性橙II完全抗原的合成方法。所制备的产品用于碱性橙的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种碱性橙II完全抗原的合成方法，以碱性橙II为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；步骤为：

(1)碱性橙II完全抗原的合成：

配制A液：10mg碱性橙II溶于4mL 0.5mol/L HCl溶液中，在冰浴条件下加入1mol/L NaNO₂，直到淀粉碘化钾试纸变蓝，反应30min，4℃下保存备用；

配制B液：30mg牛血清蛋白BSA溶于3mL pH 9.6碳酸盐缓冲液中，4℃下保存备用；

冰浴条件下将A液逐滴加入B液中，过程中保持pH 9.0，然后置4℃下温孵3h，即得碱性橙II完全抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

透析：将碱性橙II完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冷冻干燥法将透析袋中的液体制成粉末，即得到碱性橙II完全抗原；

(2)碱性橙II完全抗原的鉴定：碱性橙II完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸收系数ε，再测定碱性橙II完全抗原的偶联比。

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度，在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

摩尔吸收系数ε：配制碱性橙II浓度为0，10，20，30μg·mL^-1的20％乙醇溶液，通过紫外扫描可知碱性橙II的最大吸收波长为391nm，在391nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。

偶联比测定：配制200μg·mL^-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物完全抗原用20％乙醇稀释到200μg·mL^-1，在391nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为A1，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为：r＝[(A₁-A₂)/ε]/(200×10^-3/66200).其中ε为摩尔吸光系数(L·mol^-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，200×10^-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL^-1)。

本发明的有益效果：本发明成功合成了碱性橙II完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

附图说明