[发明专利]L-色氨酸酶法转化制备方法

说明书

一、技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及L-色氨酸的酶法转化制备方法。

二、背景技术

色氨酸(tryptophan)，又名α-氨基-β-吲哚丙酸，是Hopkins和Cole在1902 年发现并分离到的一种氨基酸。它有D-和L-型两种异构体，天然存在的只有L- 色氨酸。L-色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，因此被广泛 用于医药、食品和饲料等领域。

根据目前文献报导L-色氨酸的制备方法主要有以下三种：

1、发酵法

发酵法生产L-色氨酸大体上可以分为：直接发酵法和前体添加发酵法。

直接发酵法中常用的L-色氨酸产生菌有：谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌，枯 草杆菌，北京棒杆菌等。如Fukui(JP 1974，20：391)等由枯草杆菌选育的5-氟色 氨酸(5-FT)抗性变异株，可积累L-色氨酸9.6g/L。Nakayama等(JP 1982，5：694) 进一步改造变异株，使其具有5-FT和8-氮鸟嘌呤(8-AG)双重抗性，连续流加 邻氨基苯甲酸，可积累L-色氨酸15.6g/L。Oikawa等人(JP 2000342294，2000) 发明一种以乳酸为起始原料生产L-色氨酸的方法，即先将乳酸氧化为丙酮酸， 再与吲哚和铵离子反应得L-色氨酸。Hatakeyama等人(US 5776740，1998)采 用一步法生产L-色氨酸，即在含有甘氨酸、甲醛、吲哚和具丝氨酸羟甲基转移 酶的微生物细胞水溶液中合成L-色氨酸。目前，体内和体外的遗传操作技术已 经用于新型色氨酸产生菌的选育。

2、酶转化法

酶促转化法具有终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，它 是廉价生产L-色氨酸最为有效的方法。国内外研究者构建并筛选了高产L-色氨 酸酶和L-色氨酸合成酶基因工程菌，为用酶工程技术生产L-色氨酸奠定了基础。 在氨基酸主要生产国日本，几家大公司如三井东压、三菱油化和三乐等均采用酶 促转化法生产L-色氨酸。据文献报道(日经生物技术，1987，(1)：8)日本三 乐公司克隆了大肠杆菌色氨酸合成酶基因和丝氨酸羟甲基转移酶(SHTase)基因， 用甘氨酸为原料合成L-丝氨酸，再加入吲哚生产色氨酸，产量为90g/L。

Ishiwata等采用化学法合成DL-丝氨酸，用恶臭假单孢菌消旋酶将D-丝氨 酸转型为L型，加上底物吲哚，用大肠杆菌色氨酸合成酶进行酶促转化，产色 氨酸为110g/L。Yukawa等(Process Biotech.，1987，(12)：165)构建了带有色氨酸 合成酶基因的大肠杆菌K-12，酶促转化L-丝氨酸和吲哚得L-色氨酸200g/L。 Genex公司Hamilton等(Trends in Biotechnology，1985，8(3)：64-68)克隆了色氨酸 酶基因，以L-丝氨酸和吲哚为底物酶促转化产L-色氨酸200g/L。

国内韦平和等(中国现代应用药学杂志，1999，16(6)：37-39)利用PCR 技术扩增了JM105色氨酸酶基因，构建色氨酸酶基因工程菌WW-4，以L-丝氨 酸和吲哚为底物酶促转化产L-色氨酸49g/L，L-丝氨酸转化率为84.2％，吲哚转 化率为93.6％。张绪梅等(生物技术通讯，2006，17(1)：12-14)构建色氨酸 合成酶基因工程菌BA3，其色氨酸合成酶活性是对照菌的3.7倍。

3、化学合成法

色氨酸的化学合成途径很多，主要有以吲哚为原料及在合成过程中生成吲哚 环两大类(氨基酸杂志，1983，4：29-33)。但上述二种方法合成色氨酸或合成 路线长、或需采用价格昂贵的特殊原料、或构建吲哚环的路线反应步骤多，涉及 原料多，工艺条件较苛刻，操作难度大，而不适合大规模工业化生产。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-色氨酸的方法。

目前，在我国氨基酸生产领域和食品发酵等工业生产过程中，副产品为大量 不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的混合氨基酸，而该混合氨基酸 直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低。本发明采用富含L-丝氨酸的混合氨基 酸作为酶法制备L-色氨酸的原料，反应条件温和，色氨酸合成酶或色氨酸酶专 一性强，转化率高，可以达到转化L-丝氨酸为易于分离的L-色氨酸的目的，实 现了工业副产品的综合利用，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。