[发明专利]产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用

说明书

一、技术领域

本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用。

二、背景技术

现有技术：3-羟基丙酸(3-hydroxypropanoate，3-HP)是一种重要的功能有机酸。它易溶于水、乙醇、乙醚，可以通过化学工业中一系列成熟的催化技术转化为具有重要商业价值的化学品，如通过脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇酯化反应生成酯，以及经还原反应生成3-羟基丙酸等；3-HP还具有潜在的生物应用：例如在营养工业中，可使用3-HP作为食品和饲料添加剂或防腐剂，在一些植物体内的内生真菌中存在微量的3-HP，发现其具有杀灭寄生线虫的能力；另外，还可作为单体原料用以合成聚3-羟基丙酸[P-(3HP)]，聚3-羟基丙酸是一种新型生物可降解高分子，它不但具有良好的生物降解性和生物相容性，而且高分子量的[P-(3HP)]具有很高的机械强度和拉伸强度(>400MPa)以及较大的断裂伸长率等优异性能。而我国在该领域的研究才刚刚起步，3-羟基丙酸的应用潜力有待开发。

目前微生物生产3-羟基丙酸主要有三种途径

1、微生物转化非糖基原料生产3-羟基丙酸，

2、微生物利用3-羟基丙酸循环途径微量积累3-羟基丙酸

3、以Cargill公司和威斯康星大学等研究机构为代表的构建基因工程菌生产3-羟基丙酸，主要有两种方案：

(1)以葡萄糖为底物，在大肠杆菌中构建经乙酰-CoA的5种代谢途径

(2)以甘油为底物，在大肠杆菌中导入甘油脱水酶基因，

3-羟基丙酸是少数耐热微生物(Chloroflexus aurantiacus)胞内羟基丙酸循环途径固定CO₂过程的代谢中间物，其作为中间代谢物，通常情况难以高效率大量积累，这是由于中间产物的积累都必将破坏微生物中CO₂固定循环途径的持续进行。迄今，在自然界中尚未发现能直接利用糖质原料或甘油高效转化生产3-HPA的微生物，但3-羟基丙酸循环途径所涉及到的关键酶对于今后构建模式基因工程菌生产3-羟基丙酸将有重大指导意义。

三、发明内容

技术问题：本发明针对上述技术空白，提供一种产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用。

技术方案：一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。

一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列导入到宿主。

制备转化体方法中所述宿主为肺炎克雷伯氏菌。

制备转化微生物的方法为：利用PCR技术从醋酸杆菌基因组中扩增出如SEQ ID NO.2所示含2328个碱基对的醛脱氢酶基因aldH，从质粒载体pHY300PLK中扩增出如SEQ ID NO.3所示含1560个碱基对的四环素抗性基因Tet^R，将其串联到表达载体pUC18中，得到重组质粒pUC18-aldH--Tet^R，重组质粒转化筛选获得的肺炎克雷伯氏菌，得到重组肺炎克雷伯氏菌。

制备转化微生物的方法，制备步骤为：

(1)基因aldH的克隆：根据Genebank公布的醋酸杆菌中aldH基因的序列设计合成PCR所需的引物：

P1：5¹-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-3¹

P2：5¹-TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA-3¹

引物两端分别引入EcoR I，Xba I酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃1min40sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，Xba I酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aldH；

(2)基因Tet^R的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：

P3：5¹-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-3¹