[发明专利]乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因ilvBN

说明书

技术领域

本发明涉及乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因ilvBN的应用，属于应用环境微生物和农业领域。乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类及嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标，获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源可以构建转基因作物彻底解决除草剂对非靶标作物的药害。本发明涉及一种乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因及其含有该基因的载体和转化子。

背景技术

乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)又叫乙酰羟酸合酶(Acetolactatesynthase，ALS)，是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成第一阶段的关键酶，催化2分子丙酮酸缩合产生乙酰乳酸或丙酮酸与α-丁酮酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终合成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。AHAS是乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂如磺酰脲类、三唑嘧啶类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰氨类的作用靶标，因此具有非常重要的农学意义。乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂在中国使用量大，如磺酰脲类除草剂的研究和应用发展迅速，已经成为继有机磷、乙酰胺类除草剂后的第三大除草剂，全球年销售额达到30亿美元以上，我国磺酰脲类除草剂每年的应用面积已超过200万公顷，并仍呈扩大的趋势。乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂在土壤中积累造成的环境危害主要是对下茬作物的药害作用。现已发现磺酰脲类除草剂的残留药害可伤及水稻、大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、亚麻和向日葵等多种重要作物。特别是某些磺酰脲类除草剂如绿磺隆和甲磺隆等化学性质较稳定，在土壤中残留主要是结合态残留，半衰期长(几周到几个月)，药害更加严重，影响了正常的农业生产，对农业生产造成了巨大的损失。如在我国东北地区除草剂引起的药害非常严重，如：2005年黑龙江、吉林和内蒙古等省(区)部分地区农作物药害面积达数十万公顷。

抗除草剂转基因是解决此类除草剂药害的最佳途径，其技术路线有两条，一是获得抗乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的抗性乙酰羟酸合酶基因，二是获得能将磺酰脲类除草剂降解或代谢失活基因。目前国内外对抗磺酰脲基因转基因方面的研究和应用显得薄弱，抗药谱窄、抗性提高幅度有限、抗性不稳定或不表达和转基因作物农艺性状发生改变等问题还没有得到很好的解决；对广谱的、抗性强的、能够在作物中稳定表达的抗性基因资源发掘工作和转基因策略方面的研究还需要进一步加强。

从抗磺酰脲类除草剂的细菌中获得广谱高抗磺酰脲类的乙酰羟酸合酶基因，并将乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因通过基因工程技术转移到作物中构建转基因作物，可以从根本上防止除草剂对非靶标作物的要害。国外已有转抗除草剂基因水稻的报道，乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因在该领域有巨大的应用潜力。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因，为能“通过基因工程技术转移到作物中构建转基因作物，可以从根本上防止除草剂对非靶标作物的药害”提供可能性。

技术方案

抗乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的基因ilvBN，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。ilvBN基因核苷酸全长为：1950bp，G+C％为62.38％，编码乙酰羟酸合酶大小两个亚基，其中大亚基(催化亚基)ilvB为552个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。；小亚基(调节亚基)ilvN为95个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

ilvBN其大小亚基基因片段与酶切好的PET-29a(+)进行酶连获得含抗性乙酰羟酸合酶的PET-29a(+)重组质粒。酶连好的ilvB和ilvN基因的PET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。将乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因ilvBN通过基因工程技术转移到作物中构建转基因作物，可以从根本上防止除草剂对非靶标作物的要害。

有益效果

1.通过PCR技术扩增末端含NdeI和XhoI酶切位点的完整的乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂抗性基因ilvBN序列，将它连接到大肠杆菌高表达载体PET-29a(+)(购自Novegen公司)的NdeI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达，表达的目标蛋白占细胞总蛋白的30％。