[发明专利]一种耐有机溶剂蛋白酶及其产生菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌株以及该耐有机溶剂蛋白酶，属于微生物学与酶学领域。 

背景技术

蛋白酶广泛应用于洗涤剂、食品、制药、制革、诊断试剂、污水处理等领域。1984年，Klibanov等人发现蛋白酶在一些有机溶剂中保存较长时间仍然具有活性，而且可以催化合成肽键的反应。这一发现促进了非水酶学的兴起。大量研究表明，有机溶剂中进行酶促反应有许多优点，如有机底物的溶解性大大增强、酶的稳定性提高、防止微生物污染、产物易纯化等。更重要的是，在有机溶剂中利用蛋白酶催化合成肽，可以避免氨基酸的外消旋作用，不需要对氨基酸侧链进行保护及脱保护，因此降低成本。研究表明，只有当酶分子具有一定的构象时，才能表现出催化活力。水直接或间接地参与维持酶分子构象的非共价作用力，维持酶的活性构象变化所需的“柔性”。因此，有机溶剂尤其是亲水性有机溶剂对天然来源的蛋白酶分子的催化活性影响很大。为了改善酶在有机溶剂中的稳定性，人们采用各种方法如酶的定向进化或化学修饰、固定化等策略。但是效果并不能满足实际催化的需要。 

耐有机溶剂极端微生物能在富含有机溶剂的环境中生存，因此其所产胞外蛋白酶很有可能具有一定的有机溶剂耐受性。在已报道的有机溶剂耐受性微生物中以革兰氏阴性菌为主，仅有少量文献报道了具有有机溶剂耐受性的革兰氏阳性菌如Bacillus(芽孢杆菌属)，Rhodococcus(红球菌属)和Arthrobacter(节杆菌属)等。目前已报道的产溶剂稳定性蛋白酶的微生物多为Pseudomonas(假单胞菌属)菌株。国内关于耐有机溶剂微生物产蛋白酶的相关报道并不多。其中也未见Serratia marcescens产耐有机溶剂蛋白酶的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有优良有机溶剂耐受性能的蛋白酶及其产生菌株。 

本发明提供一种具有有机溶剂耐受性的沙雷氏菌属菌株，命名为Serratiamarcescens MH6，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武汉大学)，保藏日期2008年11月7日，其保藏登记号为：CCTCCNO：M208205。 

菌株Serratia marcescens MH6为耐有机溶剂蛋白酶产生菌。筛选过程如下： 

初筛：采用不同浓度环己烷、DMF、DMSO等有机溶剂为筛选压力从油污土样中筛选获得耐有机溶剂极端微生物。然后，采用牛奶琼脂平板培养基，从上述耐有机溶剂极端微生物中筛选蛋白酶产生菌株，共获得6株蛋白酶高产菌。 

复筛：通过检测各菌株产蛋白酶能力及所产蛋白酶的有机溶剂耐受性，从初筛菌中选取具有优良有机溶剂耐受性能的蛋白酶的产生菌。菌株MH6产蛋白酶能力最强，活力高达1204U/mL；该菌株的粗酶液具有优良有机溶剂耐受性能因此，最终选择菌株MH6作为耐有机溶剂蛋白酶产生菌。 

菌株MH6经过BIOLOG自动细菌鉴定仪鉴定和16S rDNA序列分析，表明该菌株属于沙雷氏菌属，为Serratia marcescens，并命名Serratia marcescens MH6。 

菌株Serratia marcescens MH6为革兰氏阴性短杆菌株，无芽孢，周生鞭毛，菌落为红色，大小为1μm×1.5～0.7×1.0μm。在LB培养基中生长24小时后，菌落大小为1.5～2.5mm。该菌株生长温度范围为20～45℃，最适生长温度为35℃，生长pH为5～9，最适pH为8.0，在有氧条件下生长。 

本发明对菌株Serratia marcescens MH6产生的耐有机溶剂蛋白酶进行了纯化：(1)硫酸铵沉淀法初步纯化耐有机溶剂蛋白酶。将粗酶液置于冰浴中，加入50％饱和度的(NH₄)₂SO₄沉淀杂蛋白，然后向上清液中加入(NH₄)₂SO₄至饱和度60％，获得沉淀。经检测，沉淀中的蛋白酶活力回收达到69.1％。(2)离子交换层析法进一步纯化耐有机溶剂蛋白酶。通过SDS-PAGE电泳分析，表明：经过两步纯化，该蛋白酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为52～54kDa；最终，蛋白酶纯化倍数(表3)为5.98，回收率为19.87％，比活达到42388.57U/mg。该耐有机溶剂蛋白酶，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为 52-54KDa。