[发明专利]恩诺沙星单克隆抗体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及恩诺沙星的特异性单克隆抗体及其制备方法和应用，还涉及其杂交瘤细胞株，属于免疫化学技术领域。

背景技术

恩诺沙星(enrofloxacin)是第一个畜禽专用的氟喹诺酮类药物，因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、易吸收、体内分布广等优点而被广泛应用于兽医临床预防和治疗。随着该药物在食源性动物中的广泛应用，由其引起的毒副作用如神经中毒、肾功能损伤、过敏反应、幼畜关节炎等也日益增多。由于该药物在动物性食品中的残留而诱导人类致病菌产生耐药性问题的发现，进一步加深了人们对该药的认识。为了减少该药物对人类的危害，美国禁止将恩诺沙星用于食品动物，而日本厚生劳动省自2007年5月将鱼、贝类产品中恩诺沙星的残留限量由0.1ppm调整为0.01ppm。因此，开展其残留检测方法的研究至关重要。为了监控恩诺沙星在动物性食品中的残留，联合国粮农组织(FAO)/世界卫生组织(WHO)和食品添加剂联合专家委员会(JCEFA)制定了恩诺沙星在牛、猪、禽的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)。美国FDA规定恩诺沙星禁用于食品动物，欧盟(EC)规定恩诺沙星在牛、猪、家禽的肝、肾、肌肉中最高残留限量(MRL)为30μg/kg；世界卫生组织(WHO)推荐的恩诺沙星MRL为40μg/kg。我国农业部规定恩诺沙星在肌肉、牛奶中的MRL不得超过100μg/kg。因此加强对该药在动物性食品中的残留检测和监督显得尤为突出。然而作为半抗原的恩诺沙星本身不能诱导机体产生抗体，必须将其与载体蛋白偶联获得人工合成的完全抗原才具有抗原性。而小分子抗原与载体蛋白的偶联效果及细胞融合后阳性克隆的筛选都直接影响着抗体的制备效果，是抗体制备的关键。为了建立恩诺沙星酶免疫分析方法和金标试纸，需要制备特异性强、可大量生产的抗恩诺沙星的单克隆抗体。

申请人检索发现中国农业科学(2004，37(7)：1 060-1 064)的一篇文献中介绍了恩诺沙星单克隆抗体的制备及其鉴定，主要是用碳二亚胺法合成了2种恩诺沙星(enrofloxacin，ENFX)人工抗原ENFX-BSA和ENFX-OVA，用紫外扫描和分析载体蛋白的氨基酸组成等方法对人工抗原进行鉴定，ENFX与BSA的结合比约为48∶1。用ENFX-BSA免疫BALB/C小鼠，采用显微克隆技术最终筛选出2株特异性分泌细胞2C5和5D5并获取腹水，纯化后腹水效价分别为1∶3200和1∶6 400。2C5和5D5均属IgG2a型抗体。该单抗对氟喹诺酮类药物有很高的选择性，与环丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、达氟沙星的交叉反应率分别为110.84％、27.40％、71.05％和37.41％，交叉反应率比较高，特异性不强。

发明内容

本发明的目的是：针对以上现有技术存在的缺点，提出与环丙沙星和沙拉沙星无交叉反应的，并具有特异性的、可大量生产的恩诺沙星单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供分泌该特异性抗恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明产生恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株6A4或8E6，6A4是小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.3016，于2009年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCCNo.3016；8E6是小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.3017，于2009年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC No.3017。

由小鼠杂交瘤细胞株6A4或小鼠杂交瘤细胞株8E6分泌的单克隆抗体。

小鼠杂交瘤细胞株6A4或小鼠杂交瘤细胞株8E6分泌的单克隆抗体的的制备方法，包括以下步骤：

a.制备免疫原和包被原：采用碳二亚胺法将载体蛋白与恩诺沙星偶联，合成免疫原和包被原；

b.动物免疫注射：以小鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原与等量弗氏完全佐剂混合液，进行第一次免疫注射；3周后进行第二次免疫注射；再间隔2周后进行第三次免疫注射；

c.筛选动物免疫血清：用酶联免疫吸附法和竞争酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清，对小鼠进行加强免疫注射；

d.制备杂交瘤细胞：取经过加强免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过3次亚克隆获得稳定分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体细胞株6A4或8E6；

e.制备并纯化单克隆抗体：用灭菌石蜡对小鼠进行免疫，7天后分别腹腔注射所述单克隆抗体细胞株6A4或8E6，7-10天采集腹水，用辛酸-硫酸铵盐析法对腹水纯化，即得恩诺沙星单克隆抗体。