[发明专利]氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在氨基改性固相表面固定蛋白或其他含氨基分子的方法，属于表面化学及蛋白固定技术领域。

背景技术

目前，蛋白在固体芯片表面的固定方法有多种，包括物理吸附法、化学共价法、聚合物包埋法等，其中化学共价法固定蛋白分子，具有操作简便、成键牢固的特点。利用蛋白分子表面的氨基，通过化学反应，将蛋白分子共价固定在改性芯片表面：其中包括醛基化改性表面、羧基化改性表面和环氧硅烷改性表面等。

醛基化和羧基化两种改性表面均是在以氨基为末端的硅烷类分子(如氨基丙基三甲氧己硅烷(APTMS)、氨基丙基三氧乙基硅烷(APTES)、对氨基苯基三甲氧基硅烷(APhS)等)，为自组装的修饰层基础上，再进行进一步的化学处理，最终得到带有活性功能基团的表面。

其中，采用戊二醛处理氨基改性表面，可得到醛基改性表面，通过醛基与蛋白的氨基形成西佛碱(Schiff’s base)，最终固定蛋白分子，该方法虽然已经被利用生产商品化的产品，但由于该过程反应时间较长，一般需要室温下至少反应1小时，而且形成的西佛碱不够稳定，容易发生水解，需要氰硼氢化钠将其还原；也有采用对苯二甲醛代替戊二醛与氨基反应，可增强所形成西佛碱的稳定性。但这些方法费时费力；且其中所采用的戊二醛、对苯二甲醛等毒性较大；所需的氰硼氢化钠还原剂对蛋白的影响尚不清楚，其本身也不易保存和长期使用。此外，醛基改性的硅片由于易被空气氧化，需要特殊保存条件，且不宜长期保存，所以醛基改性表面仍存在诸多缺陷。

羧基改性表面则是通过琥珀酸酐与氨基改性硅片表面反应，在硅片表面形成羧酸基团，在需要固定蛋白时，可通过N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)处理羧基改性表面，功能化后的羧基，可迅速与蛋白的氨基形成稳定的酰胺键，该反应即是蛋白内部氨基酸之间的缩合反应。采用该反应，可以缩短蛋白在表面的固定时间。虽然羧基改性表面较醛基改性表面相对稳定，可以较为方便和较长时间的保存，但该方法前期处理所需时间较长(仅羧基化改性这一步骤需3小时以上)，且固定蛋白的效率逊于醛基表面。另外，该方法由于采用琥珀酸酐处理氨基表面，反应过程缓慢，且无法控制芯片表面活化羧基的密度，而某些蛋白分子的固定效率与羧基密度的大小有关。

发明内容

本发明目的是克服现有技术存在的不足，提供一种在含氨基的表面固定蛋白分子或其他含氨基分子的方法，旨在有效避免采用醛类等有毒的挥发性物质，减少环境污染，简化羧基改性表面的处理步骤，缩短蛋白固定时间。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，特点是：首先在固相表面上组装含氨基的分子，形成氨基化的表面；用N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺混合液使多羧基化合物的羧基功能化，将功能化后的多羧基化合物与氨基化的表面反应，使功能化的多羧基化合物结合到氨基化的表面上，剩余的功能化羧基与待固定的蛋白分子或含氨基的化合物进行反应。

进一步地，上述的氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，所述固相表面为玻璃、或硅片、或金等的表面。

更进一步地，上述的氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，所述用N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺的混合液使多羧基化合物的羧基功能化，其多羧基化合物为乙二酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、乙二胺四乙酸等等。

更进一步地，上述的氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，所述N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为50mM。

再进一步地，上述的氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，所述1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺的终浓度为200mM。

再进一步地，上述的氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，所述功能化后的多羧基化合物与氨基化的表面反应时间为5～10分钟。

再进一步地，上述的氨基表面快速固定蛋白或含氨基分子的方法，所述含氨基的化合物为乙醇胺、乙二胺、三聚氰胺、氨基苯甲酸、三羟甲基氨基甲烷、氨基葡萄糖、聚丙烯酰胺、透明质酸、壳聚糖等等。

本发明技术方案突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：