[发明专利]一种枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶的发酵制备与提取的方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的发酵制备与提取的方法，其特征是工艺为：A枯草芽孢杆菌发酵，收集发酵液：

(1)出发菌株：采用枯草芽孢杆菌Zj016为出发菌株；

(2)种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2；

(3)种子培养：分为一级种子培养和二级种子培养，一级和二级种子培养基相同；

一级种子培养：取0.2mL保藏好的菌种接入250mL培养瓶中的50mL种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养8h；

二级种子培养：取一级种子液接种到种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养6h；

(4)发酵培养基组成：玉米粉25～35g/L，豆渣粉6～12g/L，K₂HPO₄2.7～3.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～0.7g/L，浓度0.1mol/L的CoCl₂1～3mL/每L培养基，调节pH至7.5；

(5)原料的预处理：

液化处理：按发酵培养基的组成将发酵培养基的原料与一定量的水混匀，将温度升高到85℃，调pH至5.6，淀粉酶的用量40U/g培养基原料，不停地搅拌，水解2h；

糖化处理：将经过液化处理后的培养基原料冷却至65℃，调pH至4.5，糖化酶的用量500U/g培养基原料，不停地搅拌，水解1.5h；

(6)发酵罐发酵条件：7L发酵罐装液量4L，接种量以体积计为4％，起始pH 7.0-8.0，培养温度35-40℃，转速400～1000rpm，通气量为2∶1v/v·min，溶氧DO与转速相协调，控制DO≥60％，培养15h；

发酵过程中的补料操作：补料的溶液为200g葡萄糖/L，补料体积为200mL，补料的方式选用一次性补料或两次补料，补料的时机根据发酵过程中的还原糖的浓度变化来确定，保持发酵液中还原糖浓度不低于2g/L；

(7)收集发酵液：将发酵液4℃、10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液；

B氨肽酶的提取：

(8)向收集的上清液中在4℃下加入质量分数为15％的(NH₄)₂SO₄，4℃、10000rpm离心10min，弃沉淀，收集澄清液；

(9)将收集到的澄清液选用截留相对分子质量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩3-5倍；

(10)向浓缩液中再加入质量分数为25％的(NH₄)₂SO₄盐析，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，取沉淀；

(11)将沉淀冷冻干燥，即得到固体的氨肽酶。