[发明专利]一种制备高活性低分子量肝素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备高活性低分量肝素的方法。属于生物医药领域。

背景技术

肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1-4糖苷键交替形成的多糖，其分子量在3000-40000Da之间，平均分子量为15000Da；肝素作为抗凝试剂和抗栓试剂已有60多年的历史。肝素的抗凝血活性主要通过其含有3-位硫酸基胺基葡萄糖的戊糖活性中心结合抗凝血酶(AT-III)，诱导其发生构象改变，从而显示抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factorXa)和抗凝(anti-factor IIa)活性。抗凝血活性还和肝素的分子量有关。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量的使用会引起出血和诱导性血小板减少、骨质疏松等副作用，从而大大的限制了肝素在临床上的应用。

低分子量肝素是由肝素通过化学法或酶法降解得到的小分子片段，平均分子量约为3000Da。低分子量肝素具有较高抗栓活性，其抗凝活性则大大降低，表现出抗血栓形成时对凝血系统影响小，因而在临床中得到广泛的应用。与高分子量肝素相比，低分子肝素具有药理学性质稳定，不需住院治疗，生物利用度高，副作用小，体内半衰期长等优点。

现有的研究表明，肝素的抗凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-，6-O-及3-O-位硫酸基参与结合AT-III，与抗凝血活性有关，而2-O-位硫酸基和艾杜醛酸的作用尚不清楚(I.Capila，R.J.Linhardt，Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41：390-412.)。其中3-O-位硫酸基尤其重要：如果缺少3-O-位硫酸基，肝素的抗凝血活性则会降低1000倍以上；相反，增加一个3-O-位硫酸基，则可以将肝素的抗凝血活性提高数倍(附图1)。适当增加6-O-位硫酸基的含量，也可以部分提高其活性。肝素由多种生物合成酶在线粒体内合成。简而言之，首先由KfiA和KfiC两种酶合成由N-乙酰基葡萄糖和葡萄糖醛酸交替共聚组成的主链结构，然后由NDST酶对N-乙酰基葡萄糖进行部分脱乙酰化反应和部分硫酸化反应，再由C5-epimerase将葡萄糖醛酸部分异构化成艾杜糖醛酸。最后，2-O-，6-O-，3-O-硫酸基转移酶(2-OST，6-OST，3-OST)分别对主链不同位置上的羟基进行部分硫酸化(U.Lindahl，M.Kusche-Gullberg，L.Kjellen，J.Biol.Chem.，1998，273：24979-24982.)，其中3-O-位硫酸化由3-OST完成。这些硫酸基转移酶大多具有多种异构形式，如3-OST就具有六种异构体。其中，3-OST-1和3-OST-5能合成肝素戊糖活性中心(附图2)。现有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-OST-1和3-OST-5很好的底物(J.Chen，M.B.Duncan，K.Carrick et.al.，Glycobiology，2003，13：785-794.)。因此，用3-OST-1和3-OST-5对低分子量肝素进行选择修饰，使80％不具有戊糖活性中心的低分子量肝素经过反应后拥有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的数量，从而提高其抗凝血活性(理论上可以同时提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。提高活性将有利于降低临床使用的剂量，减少毒副作用，减少给药次数。通过测定不同低分子量肝素的活性中心的百分含量及相应的抗凝血活性，将可以建立二者之间的定量关系，为制定不同低分子量肝素临床使用的统一标准提供依据。

由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，目前常用低分子量肝素代替肝素。低分子量肝素的优点是分子量小，皮下注射分子生物利用度高，体内半衰期长，保留了较高抗栓活性，药动学性质比较稳定，且副作用较少，因此在临床上被广泛使用。但是，低分子量肝素使用时也存在问题。低分子量肝素是由肝素通过化学降解或酶降解得到，降解导致部分戊糖活性中心被破坏，因此只有约20％的组分具有戊糖活性中心，其余80％不具有抗凝血活性(J.Fareed，D.Hoppensteadt，C.Schultz et.al.，Current Pharmaceautic Design，2004，10：983-999)。通过酶法修饰可以增加低分子量肝素抗凝血戊糖活性中心的数目，提高低分子肝素的活性，减少用药剂量，提高药物疗效的同时，降低了副作用。所以，通过酶法修饰生产高抗凝血活性的低分子量肝素具有重要的意义和广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备高抗凝血活性低分子量肝素的方法。