[发明专利]一种适用于荧光偏振技术检测基因甲基化的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及荧光偏振检测技术领域，具体涉及一种适用于荧光偏振技术中检测基因甲基化的方法。

背景技术：

DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，是在基因组内启动子区CpG岛胞嘧啶第五位碳原子上加一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程，不改变碱基序列，通过影响基因表达改变其功能。DNA甲基化水平变化是人类癌症的特征性改变，重要DNA甲基化的检测在肿瘤预警、诊断、预防及早期干预治疗、耐药性预测、科学用药方面具重要指导价值。

目前，国内外DNA甲基化检测技术主要有电泳技术、DHPLC技术、Methylight技术、微阵列技术、焦测序技术，大多数设计、操作复杂，多需要电泳和多步后处理，费时费力、成本高，仪器设备昂贵，而效率有待提高，难以大规模推广应用。

发明内容：

本发明要提供一种适用于荧光偏振技术检测基因DNA甲基化的方法，以克服现有技术存在的操作步骤繁琐、成本高、和效率低的问题。

为克服现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：

一种适用于荧光偏振技术检测基因DNA甲基化的方法，是对下述的试剂进行扩增：

所采用的试剂由MgCl2，10×反应缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，靶基因启动子区CpG岛非甲基化区引物，靶区域甲基化及非甲基化序列的3’端带荧光标记的DNA探针组成；

所采用的PCR扩增试剂包括10倍的PCR缓冲液；浓度各为2.0～2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度为0.05-0.2μmol/L的靶基因的启动子区CpG岛非甲基化区上游引物及3’端带荧光标记的探针、浓度为0.5-2μmol/L的靶基因的下游引物以及1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，其中上游引物与下游引物浓度之比为5～10∶1；

所述扩增反应条件是：94-95℃变性4-10min后，95℃孵育5-40秒，55-65℃孵育10-60秒，72℃孵育10-40秒，35-45个循环，最后一个循环无72℃孵育。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、首次将荧光偏振技术用于基因DNA甲基化检测，开辟了基因DNA甲基化检测的新技术平台。

2、首次通过应用单端标记的甲基化与非甲基化特异的探针与靶区域的杂交，导致荧光偏振值的增加，据此全面检测靶区域多个甲基化位点，检测结果更全面准确。

3、本方法步骤简单，操作简单；由于本发明应用非对称PCR、3’端荧光标记的探针及特定的扩增循环条件，实现了基因DNA甲基化检测在闭管中完成，因此不易污染，结果准确。

4、结果分析简单：结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广；可用于检测临床血液或组织标本；

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明进行详细地描述。

实施例1：抑癌基因P16启动子甲基化荧光偏振检测中，

1、所用的试剂是由：MgCl2，10×反应缓冲液，Taq polymerase，dNTPs，抑癌基因P16启动子引物，靶区域甲基化及非甲基化序列的3’端带荧光标记的DNA探针组成。

2、将上述试剂进行扩增：反应在25uL体系中进行，加入PCR缓冲液2.5μL，1.0U Taq polymerase；浓度分别为2.0mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP；浓度各为0.05uM的上游引物和3’端带荧光标记的探针混合物，浓度为0.5uM的下游引物，及过硫酸盐试剂盒处理的模板DNA 5ul.

扩增反应条件是：94℃变性5min后，95℃孵育10秒，60℃孵育10秒，72℃孵育10秒，45个循环，最后一个循环无72℃孵育。然后对扩增产物进行荧光偏振值的检测，根据荧光偏振值与对照组的差异变化判读血液或组织标本的甲基化检测结果。

实施例2：在对抑癌基因P53启动子甲基化荧光偏振检测中

1、所用的试剂是：由MgCl2，10×反应缓冲液，Taq polymerase，dNTPs，P53启动子基因的上、下游引物，靶区域甲基化及非甲基化序列的3’端带荧光标记的DNA探针探针组成。

2、将上述试剂PCR方法进行扩增：反应在25uL体系中进行，加入PCR缓冲液2.5μL，1.0U Taq polymerase；浓度分别为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP；浓度各为0.2uM的上游引物和3’端带荧光标记的探针混合物，浓度为1.5uM的下游引物，及过硫酸盐试剂盒处理的模板DNA 2ul.

扩增反应条件是：94℃变性5min后，95℃孵育5秒，61℃孵育15秒，72℃孵育20秒，45个循环，最后一个循环无72℃孵育。然后对扩增产物进行荧光偏振值的检测，根据荧光偏振值与对照组的差异变化判读血液或组织标本的甲基化检测结果。