[发明专利]一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细胞基因转染方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及牙胚的基因转染及成釉细胞的基因功能研究，特别涉及一种腺病毒载体介导的立体状态牙胚成釉细胞基因转染方法。

背景技术

基因转染是将外源性基因片段转入到宿主细胞表达，是研究基因功能的重要方法之一，以单层培养细胞作为宿主细胞的基因转染来研究其基因功能已得到广泛应用。腺病毒载体是目前表达载体较为常用的一种，通常重组的腺病毒载体包括复制缺陷型和增殖型两种；而且通过腺病毒载体的介导能够将一些外源性的基因导入一般表达载体较难导入的组织或细胞，如视网膜、呼吸上皮、胎盘和粘膜下腺等(Ehrengruber MU，Hennou S，Bueler H，NaimHY，Deglon N，Lundstrom K.Gene Transfer into Neurons from HippocampalSlices：Comparison of Recombinant Semliki Forest Virus，，Adenovirus，Adeno-Associated Virus，Lentivirus，and Measles Virus.Molecular and CellularNeuroscience 2001 May；17(5)：855-71；Takahashi M，Delivery of genes to the eyeusing lentiviral vectors，Methods Mol Biol 2004，46：439-49.)。同时腺病毒(AAV)在基因治疗方面也体现出了安全、长效等特征。

AAV-GFP表达载体是一种包含绿色荧光标记GFP基因的常用腺病毒表达载体(McCarty，D.M.，Christensen，M.，Muzyczka，N.，1991.Sequences requiredfor coordinate induction of adeno-associated virus p19 and p40 promoters by Repprotein.J.Virol.65，2936～2945；Zolotukhin，S.，Potter，M.，Hauswirth，W.W.，Guy，J.，Muzyczka，N.，1996.A“humanized”green fluorescent protein cDNA adapted forhigh-level expression in mammalian cells.J.Virol.70，4646～C4654)，利用AAV-GFP表达载体转染人胚肾AAV-293细胞，得到具有传染性的病毒颗粒。

牙胚是一个特殊的器官，可以发育最终形成未来的牙齿。牙胚的发生和发育包括牙板、蕾状期、帽状期和钟状期等，既有一定的独立性，又于周围组织存在一定的互动，牙胚内上皮和间充质来源的两种组织相互影响彼此的发生。成釉细胞是分泌牙釉质基质的一种上皮细胞，出现于钟状期牙胚，位于成釉器之中，表现为一均匀分布的细胞层，当其分泌牙釉质基质蛋白结束后，细胞会逐步退化消失。成釉细胞与周围的组织和细胞接触紧密，无法彻底分离。

目前有一些适合于牙胚体外培养的模型，这些模型采用立体培养牙胚的方法，包括采用琼脂基质、滤膜、Trowell系统等(Onishi T，Shintani S，WakisakaS，Ooshima T.Relationship of vitamin D with calbindin D9k and D28kexpression in ameloblasts，Arch Oral Biol 2008 February，53(2)：117-23；Torres-Quintana MA，Lecolle S，Goldberg M.Effects of inositol hexasulphate，a casein kinase inhibitor，on dentine phosphorylated proteins in organ culture ofmouse tooth germs.Arch Oral Biol 1998 August，43(8)：597-610)。