[发明专利]耐热菌的ELISA快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐热菌的检测方法，具体是耐热菌的ELISA快速 检测方法，属于食品微生物检测领域。

背景技术

ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)为酶联免疫分析技术 的缩写，该方法是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与 酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的分析技术。其 基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原 或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，被检样品(含 有受检的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体 结合。通过洗涤除去未结合的游离反应物，最后，结合在固相载体上的 酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物 被酶催化变为有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，使 用酶标仪即可定性或定量分析。

酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，是环状脂肪酸 芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的一员，是一种耐热、嗜酸的细菌，俗称 耐热菌。苹果浓缩汁中的耐热菌芽孢能经受酸性条件下的巴氏杀菌过程 而存活，在适宜条件下，在果汁中大量繁殖时，产生不良气味化合物， 同时使果汁产生轻微沉淀或雾状浑浊，对果汁感官品质有很大影响。尽 管耐热菌并不致病，也不产生毒素，但其引起的果汁感官性状劣变，甚 至引起果汁腐败，完全破坏了果汁的食用性和商品价值。所以，国际贸 易中对耐热菌含量要求很严，是苹果浓缩汁产品的必检项目，常常成为 苹果浓缩汁贸易中的技术壁垒，从而为苹果浓缩汁的生产、贸易和商检 提出了新的挑战。

我国鲜苹果出口量和出口额分别位居世界第一位和第五位，苹果浓 缩汁出口量居世界第一位，占60％的国际市场份额。然而耐热菌的超标 是苹果浓缩汁质量安全的一个常见问题，解决这一问题的关键之一是要 有快速、特异、灵敏的检测技术手段，以便及时反馈到生产线，实施有 效的控制，以保证产品质量与安全。

目前，国内外对苹果浓缩汁中耐热菌检测的通用方法是细菌平皿培 养记数法，检测周期为4-5天，不能及时有效控制产品质量安全。关于 耐热菌快速检测方法，有日本学者建立的RT-PCR检测方法，国内有陕 西师范大学食品工程与营养科学学院建立的PCR及QC-PCR检测方法。 基于PCR的耐热菌检测方法，虽达到了快速、特异，但对设备和实验 条件要求高，步骤较繁锁，推广应用较困难。

发明内容

本发明的目的是公开一种耐热菌的ELISA快速检测方法，解决目前 耐热菌检测方法存在的缺陷。

本发明的操作步骤如下：

耐热菌的捕集→耐热菌预增菌→耐热菌包被酶标板→封闭酶标板→ 加耐热菌多克隆抗体→加酶标抗体→加底物工作液→酶标仪测定。

本发明将样品中捕集到的耐热菌抗原包被在固相载体上，形成固相 抗原，加入封闭液，封闭没有包被到的酶标板空隙部分，从而降低非特 异性吸附。加入耐热菌多克隆抗体，其中抗体与固相抗原形成抗原-抗体 复合物，再加入酶标抗体，与上述复合物结合，此时加入底物工作液， 复合物上的酶则催化底物而显色，由于每步之间均有冲洗步骤，因此， 若样品中不含耐热菌，则耐热菌多克隆抗体、酶标抗体将被洗掉，底物 不显色而呈阴性反应；若样品中含有耐热菌，经过预增菌则可以达到所 需检测浓度，最终使底物显色而呈阳性反应。本发明简便、易行，适合 于现场检测，检测限可达国际标准，可满足苹果浓缩汁中耐热菌不得超 过1个/10mL的检测标准要求，整个操作过程可以在24小时内完成，可 成功用于果汁中耐热菌的快速检测。

具体实施方式

本发明按以下具体步骤进行：

a.耐热菌的捕集

a.1取10-20g待检苹果浓缩汁，以无菌水适度稀释，

a.2用溶剂过滤器过滤捕集耐热菌，滤膜孔径0.45μm，

a.3耐热菌被截留于滤膜表面；

b.耐热菌预增菌

b.1采用402培养基预增菌14-15h，使培养液中耐热菌浓度达到5×10⁴个/mL以上，

b.2将增菌后的培养液以10000-12000rpm/min，离心10-15min；

c.耐热菌包被酶标板