[发明专利]肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，特别涉及肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE₅-SURV/EmGFP-miR。

现有技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是指外源或内源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)进入生物体细胞后在Dicer作用下，被裂解成由正义链和反义链组成的21～23nt的小分子干扰性RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，siRNA作为向导序列，与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)结合，引起与其同源的mRNA特异性降解，抑制相应基因的表达。其是涉及基因功能、基因治疗等领域的重要研究手段。近年来RNAi技术被广泛地应用到肿瘤的基因治疗研究中。实施RNAi技术的小分子有siRNA，shRNA及miRNA。miRNA是生物体内一类重要的调控分子，多具有数十个乃至上百个靶基因。其中一些miRNA具有肿瘤抑制作用。因此，利用miRNA表达载体抑制肿瘤增殖作用的miRNA，将成为肿瘤基因治疗的新方法，具有重要的理论及实际意义。目前，商品化的miRNA表达载体多为通用性表达载体，其所选用的启动子以在大多数哺乳动物细胞中均活性很高，且能被RNA Pol II识别的启动子为准，如Invitrogen公司产品BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector Kits，Ambion公司的pSilencer^TM 4.1-CMV Expression Vectors，武汉晶赛公司基于microRNA mir-30双臂结构的shRNAmir质粒载体pGenesil-Mir30sh，所用启动子均为pol IIhuman CMV promoter。因miRNA与shRNA结构相似，故可以用miRNA的表达框架来表达shRNA。这类载体的缺陷在于其虽能保证miRNA或shRNA的正常表达，但如果将其应用于肿瘤基因治疗中时，此类载体除了在肿瘤中表达以外，还可以在正常细胞中表达，这样就可能出现在抑制了肿瘤细胞增殖的同时，还会抑制正常细胞的生长。如果能应用肿瘤特异性启动子，使得miRNA或shRNA只在肿瘤细胞中表达，就可提高肿瘤基因治疗的特异性和靶向性。

发明内容

本发明的目的是构建一种肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，通过肿瘤特异性启动子survivin promoter和厌氧反应元件(HRE)的双调控，使得该载体在肿瘤组织特异性表达，避免其对正常组织的损伤。同时实现肿瘤的多靶点或多位点治疗，提高肿瘤治疗疗效。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明以pMD19-T载体为框架载体，分别连接上五个串联的低氧反应元件HRE₅，survivin promoter，及包含GFP的miRNA表达框架，载体大小为4592bp，载体序列为：

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60

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