[发明专利]一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种产苦马豆素的内生真菌的分离方法。

背景技术：

苦马豆素是一种吲哚里西啶生物碱，其抗肿瘤活性、免疫增强作用及其抗辐射作用是十分明显的，然而制约国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程的主要问题是苦马豆素来源十分困难，远远不能满足人们研究的需要。

目前苦马豆素的来源有三种途径，第一种是从豆科黄芪属、棘豆属植物和苦马豆属植物，以及旋花科番薯属、锦葵科黄花稔属植物中提取。由于植物本身含苦马豆素的量很低，提取率低，产量有限，难以满足需求；第二种是通过人工合成途径得到，合成产物存在同分异构现象，而且有手性化合物，使得分离很困难，产率低，并不适宜大规模的工业化生产；第三种方法是从真菌菌丝体或培养基中提取即生物合成。在目前获取苦马豆素的三种途径中，人工合成途径是人们研究的重点。自美国化学家Yasuda(1984)、Bennett(1989)等先后报道人工合成苦马豆素以来，人们采用了不同的方法合成苦马豆素，可分为以下四种：①Mootoo(2001)的合成方法，关键步骤是使用氨水使二乙醛酮(keto-bisaldehyde)的氨基化降低了3倍，以保证目标物质只有一种对映异构体。该法以2，3，5，6-二-O-甘露呋喃糖(2，3：5，6-di-O-mannofuranose)为起始物，共需13步，产率为15％。②Trost(1999)和Katsuki(2000)报道的不对称合成法，以二元醇为起始物，分别需要17步和11步，产率为13％和10％。③Pearson(2002)报道的改进后的方法。以异抗坏血酸(D-isoascorbicacid)为起点，共需10步，产率为12％。④Blechert(2002)，Carretero(2000)，Pyne(2002)等报道的以吲哚里西啶顺二羟基亮氨酸(syn-dihydroxylation)衍生物开始，分别需要15步，18步和16步，产率分别为38％(以内消旋二元醇开始计算)，6.5％和4.5％。中国科学院院士周维善等(1993)人工合成苦马豆素也获成功，但产率很低。

前两种方法(从植物中提取和化学合成)，由于产量低，不能满足人们对苦马豆素抗肿瘤活性研究及其产品开发的需要。因此，探索通过产量高、提取成本低且保护环境的微生物发酵途径获取苦马豆素，就成为目前人们关注的研究热点。这就是第三种方法：从真菌菌丝体或培养基中提取即生物合成。关于苦马豆素的生物合成，目前国内申请的专利有3项即“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”、“绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺”和“白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺”。

①“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”：是由杨凌大农生物技术有限公司申请，中国专利公开号CN1396263，公开日2003年2月12日，发明创造的名称为“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”，其所采用的微生物菌株是自行从自然界豆科植物中分离、筛选的可产生苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)。其存在的不足和缺陷是，在专利中没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方法和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体生物学特性、标准、以及品质鉴定方法。这样使得同领域的普通技术人员无法按说明书的内容重复实现。

②“绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺”：是由西北农林科技大学申请，专利申请号200610043120.5，所提供的菌种是从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)。该专利保护的主要内容是苦马豆素的提取技术工艺，而不涉及绿僵菌本身的分离方法。绿僵菌在自然界中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，在中国农业科学院微生物菌种保存中心也有保藏。

③“白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺”：是由杨凌天力生物技术有限公司申请，专利申请号200710199249.X，所提供的菌种是从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准白僵菌(Beauveriabassiana Vuill)，编号为ACCC30112，也可以是其它渠道获得的白僵菌。该专利保护的主要内容也是苦马豆素的提取技术工艺，而不涉及白僵菌本身的分离方法。白僵菌在自然界中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，在中国农业科学院微生物菌种保存中心也有保存。