[发明专利]棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆及其应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆、重组及转基因烟草抗盐能力的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。 

二、背景技术

我国农作物生产中的淡水、土地等资源严重匮乏已严重制约着我国农业的可持续发展，可耕地中有近三分之一面积的土地受到不同程度盐渍化的影响，而且盐渍化耕地面积还在逐年增加。此外，我国还有15亿亩以上的荒地和滩涂是盐碱地。据保守估计，盐碱、低温等环境胁迫造成的我国主要农作物减产每年高达总产的15％以上，其中土壤含盐量是限制农作物产量的关键因素。高浓度的盐溶液能引起植物的高渗透胁迫，导致植物发育不良，生长缓慢，甚至死亡，以致大大降低农作物产量。因此，提高农作物的抗盐能力越来越受到人们的重视。早期提高作物抗盐能力的措施主要是改善土壤结构、改进栽培管理技术和传统的杂交育种。通过改善土壤结构来增强作物适应性的措施周期长、成本高。通过改进栽培管理技术来提高植物的抗盐能力的措施也收效甚微。而传统的育种方式由于育种周期长、工作量大、成本高，加之绝大多数植物缺少抗盐或耐盐基因，因此，通过传统的育种方式来提高植物的抗盐能力已远远无法满足人们的要求。近年来，植物分子生物学和基因工程技术的发展给植物抗盐育种开辟了新途径。寻找与抗盐相关的基因并研究其具体功能，通过转基因技术提高作物的抗盐能力已成为一种行之有效的方法。 

植物能产生一系列主动适应机制来应对各种内外因素的影响，并将信号在 细胞内与细胞间进行快速传递。20世纪90年代以来，细胞信号转导的研究引起了国内外生物界极为广泛的关注。近年来的研究表明，信号转导过程是一个立体网络系统，促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应途径位于网络中心，它通过磷酸化和去磷酸化将多种胁迫信号逐级放大并传递到靶分子，引起细胞的一系列抗逆反应。植物中的MAPK级联途径与机械损伤、干旱、低温、高盐、植物激素、生长发育以及病原物的侵染等各种刺激反应相关联(Jonak et al.，2004；Xiong and Yang，2003；Agarawal et al.，2002；Zhang and Klessig，1998；彭立新等，2003)。当植物受到高盐胁迫时，MAPK基因会被诱导而高效表达。 

三、发明内容

本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析。然后通过3′和5′末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术分别获得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以棉花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列，将该cDNA命名为GhMAPK16。 

该基因的全长cDNA为2030bp，其中开放阅读框部分为1662bp。由此推得，该基因具有554个氨基酸。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已发表的OsMPK16-1(水稻，EU779804)、ZmMPK6(玉米，NM_001111768)、AtMPK16(拟南芥，NM_121906)相比，氨基酸同源性分别为73.84％、76.02％、75.31％。由此表明，经过上述克隆步骤得到了编码棉花促丝裂原活化蛋白激酶 的基因GhMAPK16。 

该基因序列如下： 

序列表 

(1)SEQ.ID.NO.1的信息 

(a)序列特征 

长度：2030bp 

类型：核酸 

链型：双链 

拓扑结构：线性 

(b)分析类型：cDNA 

(c)假设：否 

(d)反义：否 

(e)最初来源：棉花 

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1 

AACTTGGTTT CTACTATTAC TTTGGGGGCT TCCTGTTTGA TGCCAATTGT TTTCTGTTTC  60 

CAAAGTTTTG ATGCTAAG CAGCCTGAT CAGAGAAGAA AGTCAGCTGC GGATGTAGAT  120