[发明专利]一种植物双价表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体的说是到一种将雨生红球藻中的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)同步转化植物双价表达载体及其构建方法。

技术背景

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。单细胞绿藻雨生红球藻在环境胁迫条件下可以合成并积累虾青素，含量高达细胞干重的4％，是其它生物的一到几个数量级，成为目前首选的天然虾青素合成工具。雨生红球藻的虾青素是在一系列酶的作用下合成的，其中β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶是两个关键酶，它们共同作用转化β-胡萝卜素形成虾青素(Grunewald K等，2000，Plant Physiol，122：1261-1268)。这两个酶皆是双功能酶，β-胡萝卜素酮化酶能分别以β-胡萝卜素和玉米黄素为底物，在C4和C4′位上引入酮基(Fraser PD等，1998，Eur J Biochem，252：229-236)；β-胡萝卜素羟化酶能分别以β-胡萝卜素和角黄质为底物，在C3和C3′位分别引入一个羟基(Linden H，1999，BiochimBiophys Acta，1446：203-212)。在玉米、花生等植物中一般不合成虾青素，所以要利用其它植物中的前体物质合成虾青素，β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶是必不可少的。

现已将雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中的bkt基因(GenBank序列号：D45881)和crtR-B基因(GenBank序列号：AF162276)克隆出来，这使得运用代谢工程手段在高等植物中合成生产大量天然虾青素成为可能，现在已经有科研人员在这一领域进行了尝试。Mann等将克隆到的β-胡萝卜素酮化酶基因与番茄pds基因启动子结合转入烟草后，植株叶片中类胡萝卜素成分及含量没有改变，但在花的蜜腺有色体中积累了高浓度的虾青素，使花的颜色从黄变红(Mann V等，2000，Nat Biotechnol，18：888-892)。结构分析显示，转基因烟草形成的虾青素与雨生红球藻形成的天然虾青素具有相同的空间螺旋特性。Ralley等将β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶基因与导肽融合，并在烟草花叶病毒的CaMV35S启动子的驱动下转入番茄和烟草，也成功地在番茄及烟草的叶片中得以表达(Ralley L，2004，The Plant Journal，39：477-486)。然而这些工作主要是将bkt或crtR-B中的单一基因转进植物，或是将两个基因连接在同一启动子下启动，而当将两个基因构建在同一载体上并分别由两个启动子启动调控时是否能提高虾青素的含量还不得而知，因此构建含有β-胡萝卜素酮化酶基因和β-胡萝卜素羟化酶基因的植物双价表达载体，使两个基因同时转入植物，对通过基因工程手段提高转化植物中虾青素合成量的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供将雨生红球藻中的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)同步转化植物双价表达载体及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1.植物双价表达载体序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示，其为β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)共同插入到pCAMBIA1301表达载体上，得到的植物双价表达载体。

2.所述植物双价表达载体总长度为12727bp，bkt和crtR-B基因的表达均由各自上游的CaMV35S启动子启动。