[发明专利]一种糖基功能化细菌毒素分子印迹柱的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖基功能化细菌毒素分子印迹柱的制备方法，本发明还涉及采用所述的糖基功能化分子印迹柱检测样本中细菌毒素的方法，属于细菌毒素检测技术领域。

背景技术

细菌毒素主要有三种：外毒素、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性蛋白，是细菌在指数生长期分泌的已知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时就具有很高的毒性。随着检测方法和分析技术的发展，人们发现细菌毒素几乎广泛存在于所有的食品和饲料中。因此，开发一种准确度高、特异性强、快速检测细菌毒素的方法，对食物中毒、水污染等突发事故作出快速诊断，并选择合适的应对措施，对于食品与环境控制以及国防安全都是十分重要的。细菌毒素的存在会威胁人类健康，造成社会经济损失，因此，细菌毒素的预防、去毒、解毒，尤其是快速高灵敏度的检测方法的建立显得十分重要。

细菌毒素的检测分析方法主要有生物学方法，如：动物测毒法和细胞测毒法；免疫学方法，如：有反向被动血凝实验(RPHA)、被动免疫溶血试验(PIH)、毒素与抗毒素琼脂扩散试验、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)；分子生物学方法，如：PCR法。这些检测方法虽然灵敏度较高，稳定性较好，但大多都有周期长，过程复杂，费时费力结果准确性等缺点。

由于大多数细菌毒素的类似物较多、新发现的细菌毒素不断增加、细菌毒素污染的普遍性和危害性被逐步认识等原因，对细菌毒素的快速高灵敏度分析方法也提出了更迫切和更高的要求。目前，限制细菌毒素检测研究的难点主要是：结构相似物较多，交叉反应普遍；毒素检测时较易受提取液中其它难于去除的干扰物质的影响等。针对当前细菌毒素危害性大、检测困难、不易预防等特点，尤其对商检和卫生防疫部门来说，更需要有一个简便、快速、灵敏的方法对细菌毒素进行检测，对其潜在危害作出判断，以促进经济发展，保障人类健康。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种糖基功能化细菌毒素分子印迹柱的制备方法。

本发明还提供了采用所述的糖基功能化分子印迹柱检测样本中痕量细菌毒素的方法，可实现对细菌毒素简便、快速、准确的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

所述的糖基功能化细菌毒素分子印迹柱的制备方法，包括以下步骤：

(1)选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的糖类化合物功能单体；

(2)将模板分子细菌毒素、功能单体糖类化合物、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按一定摩尔比混合均匀制成糖基功能化分子印迹聚合物溶液；

(3)利用表面修饰技术，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面上。

所述模板分子细菌毒素、功能单体糖类化合物、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的摩尔比为0.1～2∶2.5∶0.1～5∶40～80∶0.01～0.10∶1.0～15。

所述糖类化合物功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神经节苷脂或神经酰胺三己糖苷；所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、N、N-亚甲基二丙烯酰胺、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇三丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、N，N-二甲基酰胺或二甲基亚砜；所述有机溶剂为二氯甲烷或四氯化碳。

所述将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到玻璃管柱内表面包括以下步骤：

(1)选用长度为5-10cm，直径为2-10mm的玻璃管柱，依次用1mol/L HNO₃和1mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干；

(2)向玻璃管柱中注入糖基功能化分子印迹聚合物溶液，填满，将玻璃管柱两端封闭，浸泡5-10min，然后将玻璃管柱中的糖基功能化分子印迹聚合物溶液排出，用洗脱剂洗脱20-30min，室温下干燥5-10min；

(3)重复步骤(2)过程4-7次，制得所述糖基功能化分子印迹柱。

为除去玻璃管柱内表面过量的糖基功能化分子印迹聚合物，本发明所述的制备方法，还包括以下步骤：将糖基功能化分子印迹柱浸入pH6.8-7.2缓冲液中，保存在4℃冰箱，12～24h后使用。

所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸混合液或乙腈-乙酸混合液。所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。

本发明所述的检测细菌毒素的方法，是将按上述的任意一种方法制得的糖基功能化分子印迹柱连接到化学发光分析仪，将化学发光体系溶液与样品溶液分别泵入化学发光分析仪，对样品中的细菌毒素进行检测。