[发明专利]一种现场检测免疫芯片及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种现场检测免疫芯片或微阵列及其制备方法，为病原检测技术的改进，具体涉及一种采用标记辣根过氧化物酶技术制备用于水产养殖中现场检测一种或几种水产动物病毒的免疫芯片的方法与应用，其属于免疫学、生物芯片及诊断试剂交叉技术领域。

背景技术

病毒性疾病是水产养殖动物病害中最难以预防和治疗的一类疾病，由于水产动物所处的特定水生环境以及病毒独特的生物学特性，使得病毒病的预防及治疗较其他陆生动物更加困难。目前尚无有效的治疗病毒病的方法，因此预防病毒感染显得尤为重要，而对病毒携带者的准确检测和诊断是有效预防的基础。国内外对水产动物病毒病的诊断主要依靠实验室内对病原的检测来实现，方法主要包括电镜技术；PCR法；DNA探针原位杂交法；免疫荧光抗体技术；免疫组织化学技术；胶体金免疫层析技术；酶联免疫吸附检测法以及斑点免疫印迹检测法等。这些检测技术在灵敏度、准确性、特异性、实用性、检测成本等方面各有其优势，但在实际应用中大多需要较长的时间和专用实验设备，不适于养殖生产过程中病原的现场检测，养殖生产中急需一种凭借肉眼观察就可以判读检测结果的快速检测诊断技术。胶体金免疫层析技术检测结果肉眼可见，适用于实际生产中病原的快速、准确、现场检测，但其不能实现多样品的同时检测。因此研制一种适用于水产养殖动物病毒性病原的快速、准确、现场、简便、多样品并行处理的检测技术势在必行，以期达到早发现、早预防的目的。

蛋白质芯片技术提供了一种多样品多指标检验并行处理的方法，有效地克服了以上检测技术的缺点。常规免疫标记的蛋白质芯片，多将荧光探针标记在可与待测物质结合的蛋白质上，凭借专用设备来读取检测信号，使用范围受到一定的限制。而免疫酶技术由来已久，用途广泛，目前常用于标记的辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)性质稳定，分子量小，纯酶容易制备，经底物催化后，结果肉眼可见。将免疫酶技术与蛋白芯片技术结合，制备出一种可用于多个样品同时并行检测，检测结果肉眼可见，使用简便、快速的现场检测免疫芯片，可以很好地解决常规蛋白质芯片难以在养殖生产现场普及应用的缺点。

蛋白芯片的制备过程中，片基的选择和处理是很关键的，它不但要对蛋白质有较强的固定能力，还要保持所固定蛋白质的活性。目前大部分芯片都采用玻片作为基片，基片的修饰方式大体分为两种，一种为二维修饰，常用的有氨基、醛基、巯基、多聚赖氨酸等，利用它们的活性基团与蛋白质的活性基团以共价方式连接在一起从而达到固定蛋白质的目的，另一种为三维修饰，常用的即为琼脂糖、丙烯酰胺、硝化纤维等，与二维表面相比，其表面不仅有多孔结构，还有一定厚度，其三维多孔结构可以使蛋白质以物理吸附的方式固定在其上面，而琼脂糖是一种常用的分子生物学试剂，价格比较便宜，且具有较好的生物相容性，同时，其亲水环境还有利于保持固定在上面的蛋白质的活性，目前琼脂糖修饰片基在蛋白芯片的制备中已有应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同时检测多种水产动物样品中的病毒的现场检测免疫芯片，检测结果肉眼可见，适用于养殖生产中一种或几种水产动物病毒的快速、准确检测，及进出口水产品中病毒的检疫。

本发明的另一个目的是提供上述现场检测免疫芯片的具体制备方法及其在水产动物病毒检测中的应用。

本发明的原理是：采用双抗体夹心原理检测抗原，将水产动物病原的相应捕获抗体、阳性对照、阴性对照同时点阵于固相载体上，抗体蛋白通过共价键及物理吸附连接于固相载体上。直接将待检样品液与芯片孵育，样品中的待测抗原与固定在芯片上的相应的抗体结合，再加入辣根过氧化物酶标记的特异性单克隆抗体(单抗)探针，经底物显色后得到肉眼可见的检测结果。所述固相载体为琼脂糖修饰的载玻片。所述的待检样品液为水产动物病毒感染靶器官的组织匀浆液。