[发明专利]抗中国对虾血蓝蛋白的单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，具体讲是一种抗中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)血蓝蛋白单克隆抗体及其制备方法，其属于对虾分子免疫学技术领域。 

背景技术

中国对虾是我国重要的海水养殖经济动物，自1993年暴发的对虾白斑症病毒(WSSV)病以来，一直是严重制约着我国养虾业发展的瓶颈。基于疾病控制的目的，对中国对虾免疫机理的研究变的尤为迫切和需要。血蓝蛋白是甲壳动物血淋巴的重要组成部分，具有多种生理功能，近年来已有研究表明血蓝蛋白除载氧外，还具有酚氧化物酶活性、抗细菌和抗病毒活性、转运金属离子、储存蛋白质、调节渗透压、蜕皮激素的载体、参与表皮的固化等作用，因此，对甲壳动物血蓝蛋白的研究成为国内外学者研究的热点领域。目前普遍认为甲壳动物是通过调节血蓝蛋白的浓度和特性，执行各项生理功能，因此，可以通过利用抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体，方便快捷地检测和监测到中国对虾体内血蓝蛋白的浓度波动变化规律，为辅助诊断对虾生理健康状况提供了有力工具，同时也为更好地掌握了解血蓝蛋白在对虾各项生理功能中所起的作用有着极为重要理论和现实意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种抗中国对虾血蓝蛋白的单克隆抗体及其制备方法，为实现血蓝蛋白的免疫学检测提供了重要工具，为进一步了解血蓝蛋白在中国对虾体内的免疫功能起到重要作用。 

本发明的任务是由以下技术方案实现的：研制了一种抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞CS-H，保藏号为：CCTCC-C200937，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2009年05月11日的杂交瘤细胞分泌的。 

与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于分子量为73kDa和75kDa的中国对虾血蓝蛋白的两个亚基上。 

一种所述抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：首先，抽取中国对虾血淋巴经离心分离血浆，经超速离心获得中国对虾血蓝蛋白粗提物，利用对虾白斑症病毒(WSSV)亲和层析，纯化中国对虾血蓝蛋白，经电泳分析和多肽质谱分析确认后，以亲和纯化的血蓝蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，经过免疫学检 测筛选方法，筛选出分泌抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞CS-H，然后采用常规方法培养上述所得到的杂交瘤细胞CS-H，收集细胞培养上清液，经纯化后得到鼠抗中国对虾血蓝蛋白的单克隆抗体。 

所述的免疫学检测筛选方法是：间接酶联免疫法，转印免疫印迹法和免疫沉淀法。其中所述的间接酶联免疫法和转印免疫印迹法综合确定该单抗与中国对虾血蓝蛋白特异性结合反应真实存在；所述的转印免疫印迹法确定该单抗的抗原决定簇位于分子量为73kDa和75kDa的中国对虾血蓝蛋白的两个亚基上。 

一种所述抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体在制备检测中国对虾血蓝蛋白在血淋巴中含量变化的试剂中的应用。 

一种所述抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体在制备研究血蓝蛋白在中国对虾非特异性免疫应答中功能的试剂中的应用。 

本发明的单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示：单抗能与中国对虾血浆中的血蓝蛋白发生特异性结合；免疫共沉淀结果显示：与对照例相比，本发明的单克隆抗体能特异性沉淀未变性的中国对虾血蓝蛋白，沉淀的血蓝蛋白经电泳分析显示为73kDa和75kDa两个亚基。 

本发明的单抗经转印免疫印迹检测结果显示：变性后的血蓝蛋白的两个亚基结合有该单抗，即表征本发明的单抗的抗原决定簇位于分子量为73kDa和75kDa的中国对虾血蓝蛋白的两个亚基上。 

在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增殖能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体。 

本发明的优点在于：由于本发明制备了抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体，为研究血蓝蛋白在对虾非特异性免疫应答及其它生理功能提供了重要工具。由于本发明重要的制备技术路线是：通过超速离心与亲和纯化获取血蓝蛋白，经质谱鉴定后作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，再经过免疫学检测筛选方法筛选出抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体。这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。