[发明专利]苏木素在测定细胞增殖活性和药物对细胞毒效应中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及苏木素在测定贴壁细胞增殖活性和药物对贴壁细胞毒性作用中的应用。

背景技术

随着抗肿瘤药物开发的日益深入，愈来愈多中药的抑瘤作用被世人关注，对这类药物或 其提取物进行体外筛选亦是药物开发过程的重要环节。采用稳定、可靠的检测方法观察药物 对不同细胞系体外增殖抑制活性是必需的。

观察细胞增殖活性及细胞毒性作用，常规采用四类方法：1、同位素方法，主要有³H-TdR 掺入法、¹²⁵I-UdR及⁵¹Cr释放法，虽然这类方法敏感、特异，但存在对环境污染及需复杂昂贵 的仪器设备等诸多弊端。2、流式细胞仪分析法同样具有敏感、特异等优点，但亦须昂贵复杂 的仪器设备，不易在基层推广应用。3、Giemsa染色法、结晶紫、台盼兰等染色法，虽然简 便、经济，但存在结果不稳定和严重的非特异性吸附等缺点。4、酶底物法主要有传统的MTT 比色法等，其特点是以活细胞的某种酶和相应底物之间的反应来显示细胞数量和生存状态， 优点是敏感快速及重复性较好，且对人体无损伤，通过对此方法的不断改进完善，多年来一 直广泛应用于细胞增殖和细胞毒性作用等研究领域。CCK-8是MTT的一种升级替代产品，其 作用原理与MTT相似，与MTT相比具有敏感性更高，且操作更简便等优点，非常适合用于细 胞增殖和一般化学药物的细胞毒性实验。本研究在采用MTT比色法和CCK-8比色法观察中药 提取物金荞麦对肿瘤细胞的毒性作用时发现MTT和CCK-8均与金荞麦提取物发生不同程度的 非特异性反应，致使结果波动范围较大，剂量依赖关系不明显。基于上述所述，寻找特异、稳 定、简便、经济的体外药物筛选方法已成当务之急。

苏木素是一种天然染料，通过氧化变为苏木红，通常用于生物组织切片细胞核的染色。 本研究将苏木素用于检测贴壁细胞增殖和药物对贴壁细胞毒性作用，苏木素仅能被固定前的 活细胞吸附，活细胞数量越多，状态越好，则染色越深，所测OD值越高；反之，活细胞数 量越少，状态越差，则染色越浅，OD值越低，从而间接对活细胞的数量进行定量。目前尚 无将其用于测定贴壁细胞系体外增殖活性和药物对贴壁细胞毒性作用的研究和报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了苏木素的一种新用途，即苏木素在测定贴壁细胞增殖 活性和药物对贴壁细胞毒性作用中的应用。本发明还建立了一套测定贴壁细胞增殖活性和药 物对贴壁细胞毒性作用的检测方法。本发明的检测方法具有特异、稳定、简便、经济等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用苏木素测定贴壁细胞增殖活性的方法，步骤如下：取已稀释好的待测细胞悬液， 置于细胞培养板的各相应孔中，每孔200μl，于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度条件 下，孵育44小时，甩弃上清，立即加入4％的多聚甲醛溶液，每孔100μl，固定20分钟后收 集固定液(可反复利用)，PBS洗3次，每次200μl/孔，弃上清，室温晾干；取苏木素染色 液，每孔加入100μl，20分钟后收集染色液(可反复利用)，蒸馏水洗3～5次，以去除未结合 的染料，室温晾干；于倒置显微镜下观察细胞着色状况，再加入1％的盐酸酒精，100μl/孔， 此时各孔液体呈现不同程度的粉红色，20分钟内用酶标仪测定540nm处的吸光度值并记录， 取各组OD值均数并绘制细胞系增殖曲线。

一种利用苏木素测定药物对肿瘤细胞系毒性作用的方法，步骤如下：取待测细胞液，置 于细胞培养板的孔板中，每孔200μl，同时设定无药物细胞对照和培养基酶标仪调零孔，于 37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度条件下，孵育44小时；取出细胞培养板甩弃上清，立 即加入4％的多聚甲醛溶液，150μl/孔，固定20分钟后收集固定液；PBS洗3次，每次200 μl/孔，弃上清，室温晾干；取苏木素染色液，每孔加入100μl，20分钟后收集染色液；蒸 馏水洗3～5次以去除未结合的染料，室温晾干；于倒置显微镜下观察细胞着色状况，再加入 1％的盐酸酒精，100μl/孔，此时各孔液体呈现不同程度的粉红色，20分钟内用酶标仪测定 540nm处的吸光度值并记录，按下式计算药物的抑瘤率：

其中，OD值(试验孔X)表示实验组各孔OD值的均数；OD值(细胞对照孔X)表 示无药细胞对照组各孔OD值的均数。