[发明专利]一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其生物学特性，以及其在生物学上的应用。 

背景技术

禽流感病毒(AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，基因组分为8个节段。核酸总长度约为13.6kb，编码至少11个病毒蛋白。由于AIV负链、分节段的RNA病毒性质，病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。AIV据其致病性可分为高致病性AIV(Highly Pathogenic Avian Influenza virus，HPAlV)和低致病性AIV(LowPathogenic Avian Influenza virus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV和LPAIV分别以H5和H9亚型为主。 

自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型的病毒不断传播，目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染。H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV的主要亚型，占禽流感总发病率90％以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30％)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。AI不仅对我国的养殖业造成了严重损失，而且对人类健康也构成了威胁。我国在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和扑杀的政策，实践证明该政策对控制禽流感的大规模流行起到了重要作用。积极开展流行病学调查，密切追踪AIV的分子进化和抗原变异，选择免疫保护性好的H9N2流感病毒疫苗株，才能保证疫苗良好的免疫效果。 

世界范围内的H9N2 AIV可分为北美谱系和欧亚谱系。而欧亚谱系又可分为：A/chicken/beijing/1/1994-like(BJ 94)分支、A/quail/Hongkong/G1/1997-like(G1 97)分支、A/duck/Hongkong/Y439/1997-like(Y439 97)分支以及国内近年来出现的A/shanghai/F/1998(F98)分支。鸡群是中国国内数量最大的禽群，也是人类最常接触到的禽类。所以对鸡群进行长期的AIV分子流行病学监测，密切观注其传播和进化情况，具有重要的公共卫生学的意义。 

发明内容

本发明的发明人提供了一种重组的鸡源的A/chicken/Shandong/B4/2007 H9N2禽流感病毒毒株，并提供了该毒株的全基因组序列，阐明其8个基因片段与国内经典的H9N2病毒株在系统进化上的差异，从而为H9N2病毒的分子进化和流行病学研究提供资料，同时提供了该毒株的分离、鉴定和纯化的方法以及该毒株的部分生物学性质，以明确其作为H9N2流感疫苗侯选毒株和HA-HI实验抗原的可行性。 

发明人对该毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：V200812。 

该病毒的全基因序列如说明书中所示，其中其HA、NA、NS基因隶属于BJ 94分支，NP、PA、PB2和PB1基因隶属于F 98分支，M基因属于G1 97分支，加之该病毒的全基因组序列测定表明，因此，这是一株重组毒株。 

针对该病毒的特性，发明人采用的分离及鉴定方法如下： 

取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体。加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通过血凝试验检测尿囊液的HA效价，并据此制备4单位病毒，用标准的H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定病毒为H9亚型AIV与NDV的混合感染。 

为了得到纯化的病毒，发明人采用的纯化方法如下： 

首先使用ND阳性血清中和法进行初步纯化，然后再用有限稀释法进一步纯化。最终收获的含毒尿囊液再次通过H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定表明获得了纯化的H9亚型AIV。 

通过上述方法得到的纯化的H9亚型AIV，可以进行下述的各种操作，其确定其各种性质： 

1.病毒在鸡胚中的生长特性该病毒在鸡胚中可高滴度生长，血凝素效价稳定在2¹⁰左右。