[发明专利]小轴海绵不同类型细胞和细胞团的分离制备方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，涉及海洋动物细胞的分离、培养以及活性天然产物的代谢研究和生产技术，具体地说是小轴海绵(Anixella sp.)中包括小球细胞在内的四类细胞和三种细胞团的一套分离制备方法。本发明得到的高纯度的小球细胞可用于活性物质的代谢研究和优化提取，不同类型的细胞团可用于体外培养生产活性物质。

背景技术

海绵是最低等的多细胞动物，体内含有多种结构新颖功效独特的活性化合物，具有广阔的药物开发前景。以本专利涉及的小轴海绵(Anixella sp.)为例，其所含的生物碱Debromohymenialdisine(DBH)和Hymenialdisine(HD)具有治疗老年痴呆和骨关节炎的效用，目前分别处于临床I期和临床前试验期。由于野生海绵生物量不足以满足药物研发和市场化的需求，利用海绵细胞离体培养进行活性物质代谢已经成为国际上的研究热点。此类研究的重要前提在于明确培养对象和调控目标，即明确培养的细胞类型和细胞分化的调控方向。因此在进行细胞培养和代谢调控之前，必须探明活性物质所在的细胞类型，即进行活性物质在细胞中的定位考察。

活性物质的定位研究主要依赖于细胞分离技术，密度梯度离心是目前针对某一特定类型细胞进行富集的主要手段，然而这一方法的缺陷在于得到的细胞纯度较低，难以真正实现富集。孙黎明等曾用多方法联合对繁茂膜海绵中的原细胞进行了富集，但是目前的研究表明，海绵中的含溴生物碱主要是由小球细胞代谢和储存的。由于小轴海绵本身与繁茂膜在细胞构成上就具有较大差异，并且原细胞和小球细胞的特性也迥然不同，因此针对原细胞的富集方法无法应用于小球细胞。建立一套针对小球细胞的高纯度的富集方法，不但能够为活性物质的定位和定量提供重要的实验材料，还能促进代谢途径和分子标记的研究。并且，对富集后的小球细胞进行提取，可以避免其他细胞中所含物质(比如色素等)的干扰，有利目.标活性物质的分离和纯化。

在海绵细胞培养方面，目前已建立的有混合细胞团培养体系和原细胞团培养体系。混合细胞团培养体系一般是将海绵组织整体离散，所得的细胞直接培养或初步分离后培养。原细胞团培养体系是对海绵中的原细胞进行富集后接种培养。原细胞被认为是海绵中的多能干细胞，具有增殖和多向分化的能力。但有研究表明，海绵中的领细胞也可以退分化为原细胞并实现增殖和多向分化。因此，除原细胞外，建立以领细胞等其他细胞类型为主的团培养体系，对细胞分化和活性化合物代谢研究也具有重要意义。

迄今为止，国内外尚未有针对小球细胞的富集方法，对海绵中多种细胞进行分型的细胞团培养方式，也未见相关报导。上述方法的建立，具有理论研究和实际应用的重要价值和迫切性。

发明内容

本发明的目的在于提供一套分离小轴海绵中不同类型细胞和细胞团的方法。利用细胞的特殊聚集性质和并结合各类离心技术，实现海绵中小球细胞、灰细胞、原细胞和领细胞的纯化，并得到三种类型的细胞团(以小球细胞为主的I型细胞团、以原细胞和灰细胞为主的II型细胞团，和以领细胞为主的III型细胞团)。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

利用小球细胞具有在含高浓度EDTA的CMFSW中聚集的性质，采用特异性聚集、低速离心、速率沉降、高速离心和密度梯度离心的方法，实现四类海绵细胞的富集，以及三种细胞团的制备，可按如下步骤操作(图1)：

(1)小球细胞特异聚集：取健康洁净的小轴海绵组织，切成约0.5-2mm厚的片状，在含高浓度的EDTA的CMFSW中用镊子轻轻挤压，细胞逸出得到混合细胞液，混合细胞液经300-350目筛绢过滤后于平皿中静置，等待小球细胞特异聚集成团块，水平振荡平皿使细胞和团块重悬混匀，小球细胞聚集体具有较高的下降速率，最先沉降到皿底部，吸取上清细胞悬液(细胞悬液A)，平皿中剩余的细胞聚集体即为小球细胞富集体，对该聚集体用无菌天然海水进行培养，得到I型细胞团；

具体为：