[发明专利]水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品中病原微生物的检测方法，尤其涉及利用mPCR-DHPLC技术检测水产品中致病性弧菌的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。

背景技术

随着生活水平的提高以及我国加入WTO后的逐步开放，人们对水产品的需求不断增大，同时水产品的进出口贸易也在扩大。然而，水产品中致病性微生物、尤其是致病性弧菌的监控和检测一直是限制我国水产品贸易的重要问题之一。1998年和2000年我国出口到法国的鳕鱼片和出口到瑞典的水产品被检出创伤弧菌和拟态弧菌而遭取消代号处理。2001年起我国出口到韩国的水产品全部要求检验霍乱弧菌，因此致病性弧菌的检验越来越受到重视。

现有的检测方法中，对水产品中致病性弧菌的检测仍采用常规的微生物检测方法，这些方法费时费力，无法满足快速高通量检测的要求，检测时还会出现假阳性，影响结果分析，可能会带来较大的经济损失。并且，现有的微生物学检验方法无法提供准确的分型信息。而水产品检测中经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌。因此，有必要研究一种方法，可同时针对多个致病性弧菌，快速且大批量进行检测，并且能够在检测出时能快速分型。

变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离的方法，因此，也有人称该技术为温度调控离子对反相高效液相色谱。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。DHPLC技术检测微生物是很好的培养不依赖的混合微生物样本的分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术在已知和未知基因突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。

本发明人即旨在建立利用DHPLC技术的能快速、高通量检测多样本、多种弧菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快捷地检测样品、尤其是检测水产品中致病性弧菌以判定待检样品是否受到污染的mPCR-DHPLC检测试剂盒及其检测方法。

首先，本发明所述的水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒包括：

1mL检测溶液含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U(5U/μL)及5种致病性弧菌上、下游引物对各10μM；

其中，这5种水产品中致病性弧菌的目的基因及特异性引物序列如下：

本发明还提供了利用上述试剂盒检测水产品中致病性弧菌的检测方法，包括如下步骤：

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14μl灭菌超纯水，总体积25μl；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B；

                0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；

                3.6min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B；

                6.8min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；

                9.9min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B；

                13min，35.0％缓冲溶液A，65.0％缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。