[发明专利]筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程疫苗生物技术领域，涉及筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法。

背景技术：

艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)是本世纪以来对人类威胁最严重的传染病。艾滋病病毒对人体免疫功能的破坏所产生的难以治愈的感染和肿瘤已经威胁了人类社会的生存和发展。特别是艾滋病在传播蔓延过程中一个最引人关注的现象是，全球艾滋病病毒新感染者中，青少年占一半以上。目前，尚未有能从根本上彻底治疗和预防艾滋病的有效药物。现行的各种治疗措施都是尝试性的。由于艾滋病主要是和免疫系统有关的疾病，因而获得可靠的免疫预防保护是从根本上解决艾滋病流行传播的关键。人获得性免疫缺陷病毒(HIV)作为反转录RNA慢病毒，是传播AIDS的主要病原体。核心蛋白(gag)是HIV的主要结构蛋白之一。gag蛋白能够诱导动物产生包括中和抗体的体液免疫和细胞免疫，并能够自我装配形成病毒样粒子(Virus-like particle，VLP)。表面具有活化B细胞的一级结构表位和诱发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，氨基酸序列相对保守，是新型疫苗设计的理想区域。有关HIV疫苗的研制多数是围绕着外膜蛋白(env)展开的，而本项发明利用HIV核心蛋白(gag)基因片段，构建在真核细胞表达的融合基因。表达的蛋白产物即可作为抗原进行免疫预防，又可作为诊断试剂筛查感染人群。

发明内容：

本发明的目的是提供一种分子生物学领域的操作技术，通过构建一个基因重组表达质粒，筛选出一株含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒。

本发明是通过如下技术方案实现的：

将编码人干扰素α-2b的基因序列与编码人HIV-1gag基因融合，构建读框吻合的外源融合基因片断，并克隆到痘苗病毒表达载体pJ38中，构建了含有HIV-1gag和IFNα-2b外源融合基因的重组表达质粒：pJ38gag/IFNα-2b，在真核细胞中忠实地翻译了原有的基因序列，连续稳定地表达了gag/IFNα-2b融合蛋白，pJ38gag/IFNα-2b基因表达产物在体外能与HIV-1gag阳性血清发生特异性反应，具备免疫原性和免疫反应性，无返祖现象。为研究艾滋病病毒结构蛋白的的抗原性，提供了一个获得艾滋病病毒核心蛋白的途径。为研究艾滋病感染者的检测诊断试剂与免疫预防治疗提供重要的理论依据。

本发明的技术解决方案包括以下步骤：

1.pJ38gag/IFNα-2b基因重组与鉴定

在无菌条件下制备大肠杆菌感受态细胞，置-70℃超低温冰箱冻存，用于转化质粒。采用CaCl₂转化的方法，将含有目的基因的载体质粒转入E.coliHB101、JM109、DH-5α、JM101甲，在含50μg/ml Amp的LB液体培养基中37℃振摇培养24h，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，当溴酚蓝电泳至适当位置后，用长波紫外灯观察并记录结果或拍照保存，采用分光光度计测定法检测260nm和280nm的光密度OD值，计算提取质粒的浓度，置-20℃冰箱中保存，备用于连接反应。DNA目的基因片断与载体的回收根据实验目的和DNA分子量大小分别采用冻融法、DEAE-81纤维素膜电泳回收法、低熔点琼脂糖凝胶回收法与透析袋法。酶切DNA片段的3’凹端补平与线性质粒DNA的5′端去磷分别采用dNTP、Klenow大片段与牛小肠碱性磷酸酶(CIP)分别置室温、37℃、55℃、75℃反应，将3’凹端补平与5′端去磷的线性质粒DNA用适量T4DNA连接酶(0.5weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃1h。进行连接反应。重组子的筛选和鉴定采用酶切法。挑选酶切结果与理论预计值相同者进一步用两种以上内切酶消化，所有酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组质粒。结果构建了内含目的基因片段gag/IFNα-2b(nt531-nt1507+nt336-nt1171+nt1507-nt1712)，分子量约为8.351kb的重组表达质粒pJ38gag/IFNα-2b。

2.pJ38gag/IFNα-2b在真核细胞中表达与鉴定