[发明专利]一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法。特别涉及到的是 利用基因定点突变酵母细胞高灵敏度的筛选抗朊病毒药物的方法。

背景技术

朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、 库鲁病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极 大的危害。目前，全世界的研究者们正致力于寻求建立高通量抗朊病毒药物筛 选平台的研究，从而尽快研发出预防和治疗朊病毒引发疾病的药物。

目前，在美国和欧洲有关抗朊病毒药物的研发领域中，主要利用动物细胞 模型来筛选抗朊病毒的药物。但是由于这个筛选系统技术上的复杂性，只能局 限在少数化合物中进行；更重要的是，由于这个筛选系统的实验成本过于昂贵， 又具有哺乳类动物内朊病毒交叉传染的危险性，需要P3级以上的无菌实验室和 大量的高级技术人员的工作才能保证药物筛选的进行，使得大规模的在已知化 合物的范畴内筛选抗朊病毒药物缺乏实用的可能性。最近的研究表明，建立在 野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)上的抗朊病毒药物筛选模型在 很大的程度上可以取代动物细胞模型，并且具有经济、简单、安全的特性。但 是野生型酵母细胞作为抗朊病毒药物筛选模型仍存在着缺陷和不足：由于对药 物的敏感度较低，使得待测药物用量较大，并容易造成药物筛选时假阴性过高， 可能漏筛某些温和型的抗朊病毒的药物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明根据野生型酿酒酵母细胞(Saccharomvces cerevisiae)中分子伴侣Ssalp对于朊病毒[PSI⁺]的调控机理，通过基因定点突变 酵母细胞内分子伴侣SSA1基因，提供一个高灵敏度的抗朊病毒药物筛选的酵母 细胞模型，从而降低待测药物用量，降低药物筛选时假阴性的比率，使得能在 更大的范围内高通量筛选抗朊病毒药物。

本发明选用的菌种是野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)来自 于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为 208719。这种酿酒酵母带有[PSI⁺]朊病毒，固体菌落颜色为白色。

本发明的技术方案是基于分子水平的朊病毒的致病机理，以及细胞内分子 伴侣在朊病毒的形成过程中的调控作用原理，使用基因突变技术改造了野生型 酵母细胞对抗朊病毒药物敏感度低的缺陷。

本发明采用的技术方案是：一种高灵敏度的利用基因突变酵母细胞筛选抗 朊病毒药物的方法，步骤如下：

1)SSA1-YS1酵母细胞的制备：

将野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)内的分子伴侣SSA1基因 编码的第483位亮氨酸突变为色氨酸，得到基因突变型SSA1-YS1酵母细胞，其菌 落颜色为粉色；

2)筛选抗朊病毒药物：

SSA1-YS1酵母细胞的活化：取SSA1-YS1酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃ 振荡过夜培养；

SSA1-YS1酵母细胞初始OD值的调试：调制SSA1-YS1酵母细胞悬液 OD₆₀₀＝0.5；

筛选待测药物：取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调 试好的SSA1-YS1酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一 天冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌 冻存管中，振荡培养1～5天；

检测：从第一天起，隔天提取100μl前一天的冻存管中的SSA1-YS1酵母细胞 悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好SSA1-YS1酵母细 胞悬液的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，观 察SSA1-YS1酵母细胞的颜色。

通过SSA1-YS1酵母菌落颜色的变化观察待测药物对于朊病毒的治疗效果： 菌落(即SSA1-YS1酵母细胞)为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌 落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[PSI⁺] 的治愈率：愈率＝变红的菌落数/总的菌落数×100％。