[发明专利]分子内共价交联蛋白质作为免疫测试中的结合配偶体的用途

说明书

本申请是申请号为01819885.6申请的分案申请，申请号为 01819885.6申请的申请日是2001年11月27日。申请人是霍夫曼-拉 罗奇有限公司。

本发明涉及分子内共价交联蛋白质的用途，特别是来自HIV的分 子内共价交联的逆转录酶作为免疫测试中免疫结合配偶体 (Bindepartner)的用途，其中使用分子内共价交联蛋白质作为结合 配偶体的检测样品中分析物的免疫测试方法，涉及来自HIV的分子内 共价交联逆转录酶和这种逆转录酶的制备方法。

蛋白质作为用于在免疫诊断试验方法中检测分析物的结合配偶体 的用途已经公知了很长时间了，在所有的常规免疫测试中，样品与一 种或多种对该分析物特异性的结合配偶体温育。这一种或多种结合配 偶体特异性结合要检测的分析物。在抗体试验的情况下，例如在HCV 感染情况下，要检测的样品例如与特异性结合要测定的抗-HCV-抗体 的HCV抗原接触。在例如为了检测肿瘤标记物前列腺特异性抗原(PSA) 的抗原试验中，样品与特异性结合样品中PSA的抗体接触。

接着在所有的免疫测试中检测分析物。可以例如通过结合并且接 着检测另一种结合配偶体来进行，所述结合配偶体带有与分析物和免 疫结合配偶体形成的复合体结合的可检测标记。

免疫测试一般以异源或同源试验形式进行。异源试验形式常常以 夹心或桥式试验进行。竞争方法是公知的，其中通过例如加入标记的 分析物类似物从分析物和特异性结合配偶体的复合体置换分析物或者 特异性结合配偶体。

在所有的免疫测试方法中，用作特异性免疫结合配偶体的反应物 以稳定形式存在并且它们不会被例如因为不适宜的贮存条件破坏这一 点是重要的。特别是当用作特异性结合配偶体的蛋白质由几个亚基 (Untereinheiten)构成时才出现这种危险。所述亚基可以通过共价 键，例如通过二硫桥，或非共价键，例如通过氢桥，相反电荷和/或疏 水性相互作用连接在一起。

在某些情况下，免疫测试需要的材料(例如作为液体试剂)在为 试验制备的工作溶液中在贮存条件下或者在免疫反应期间本身可能变 得不稳定并变性。结果蛋白质的三级和四级结构可以以这样一种方式 变化，使得该物质不再能够在免疫测试中使用。

可以在不适宜的条件下彼此分开用作特异性结合配偶体对的蛋白 质的亚基成分。在天然共价桥的情况下，可以例如通过普通缓冲液添 加剂例如DTT将二硫桥还原以引起亚基的离解。

但是，通过电荷或疏水性作用结合在一起的蛋白质的非共价连接 亚基的离解的危险甚至更大。这样的蛋白质的亚基即使通过普通缓冲 添加剂，例如盐或去污剂或者不适宜的pH-和温度变化都非常容易离 解。因此各个的在一定程度上没有保护的亚基也容易变性。这可能导 致蛋白质的三级结构或者各个亚基的大的变化。这也意味着免疫学性 质，例如重要表位的可接近性变化到这样的程度，使得在免疫测试中 用作结合配偶体的蛋白质不再被免疫识别，即不再特异性结合。

亚基离解的另一个危险是带有不同的标记基团的亚基由于化学平 衡调节而再次离解。在一个具体的情况下，在桥式试验形式中在抗体 试验中使用的两个亚基构成的蛋白质一方面为了使用普遍适用的固相 而被衍生化，另一方面，相同的蛋白质也被用作产生信号的成分，并 且为了这个目的与标记物(例如酶，荧光素或化学发光标记)偶联， 所以可能发生下面的情况：最初由阳性样品(含有分析物的样品)产 生的校正曲线随着时间的进程而变平。阴性样品(空白值)信号增加 并且越来越增加接近上面的阳性样品值使得不再可能区分没有分析物 和含有分析物的样品的差异。

德国专利申请DE2615349中描述了通过与醌反应而化学修饰酶的 方法。这些修饰作用提高了导致提高的酶活性的稳定性。指明了酶分 子可以彼此交联，即分子间和分子内交联。在这种情况下免疫反应表 位的保留不起任何作用。没有描述在免疫诊断方法中使用用醌修饰的酶。