[发明专利]实时序列测定

权利要求书

1.含有聚合酶的组合物，其包含分子标记、引物、模板和对应该聚合酶的单体类型，所述标记与该聚合酶上的位点相连，至少一种单体类型包括与该单体的β-、γ-或末端-磷酸基连接的分子标记，至少一种所述标记是具有能在单体掺入时被检测到的荧光性质的荧光标记，且单体掺入的顺序与模板中单体的相应顺序的互补体对应。

2.权利要求1的组合物，其中所述聚合酶是逆转录酶。

3.权利要求1的组合物，其中所述聚合酶选自Taq DNA聚合酶I，T7DNA聚合酶，测序酶，和大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。

4.权利要求2的组合物，其中所述逆转录酶是HIV-1逆转录酶。

5.权利要求1的组合物，所述聚合酶标记包含供体荧光标记，每种单体类型包括不同的、与该单体的β-、γ-或末端-磷酸基连接的受体荧光标记，且其中所述荧光性质是在每一次掺入单体之时在聚合酶标记与掺入单体上的标记之间的荧光共振能量转移(FRET)。

6.权利要求1的组合物，其中所有标记都是荧光标记，且荧光性质包含荧光发射光的强度和/或频率。

7.权利要求6的组合物，其中所述荧光性质是荧光共振能量转移(FRET)，其中单体标记是供体荧光标记而聚合酶标记是受体荧光标记，或聚合酶标记是供体荧光标记而单体标记是受体荧光标记，且其中当两种标记彼此靠近时发生FRET。

8.含有聚合酶的组合物，其包含供体荧光标记、引物、模板和对应该聚合酶的单体类型，所述标记与该聚合酶上的位点相连，所述模板含有未知的核苷酸序列，每种单体类型包括不同的与该单体的β-或γ-磷酸基连接的受体荧光标记，在每一次掺入单体之时在聚合酶供体荧光标记与掺入单体上的荧光受体标记之间发生荧光共振能量转移(FRET)，且单体掺入的顺序与模板中单体的相应顺序的互补体对应。

9.权利要求8的组合物，其中所述聚合酶是逆转录酶。

10.权利要求8的组合物，其中所述聚合酶选自Taq DNA聚合酶I，T7DNA聚合酶，测序酶，和大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。

11.权利要求9的组合物，其中所述逆转录酶是HIV-1逆转录酶。

12.单分子测序装置，其包含

第一小室，其容纳有至少一种复制复合物，该复合物包含聚合酶，引物和模板，所述聚合酶具有与其位点连接的供体荧光标记，

第二小室，其容纳有对应所述聚合酶或逆转录酶的脱氧核苷三磷酸(dNTP)类型，且部分或全部的dNTP具有受体荧光标记与其β-或γ-磷酸基连接，

连接这些小室的通道，其中在每一次掺入dNTP之时在聚合酶标记与掺入的dNTP上的标记之间发生荧光共振能量转移(FRET)，且单体掺入的顺序与模板中单体的相应顺序的互补体对应，和

适于在CCD照相机视野内检测荧光、并将FRET事件转换为每一复制复合物的dNTP掺入顺序的检测仪，所述荧光在每一复制复合物产生FRET事件时产生的。

13.权利要求12的装置，所述第二小室包含4个小室，每一种dNTP类型一个小室，且不同dNTP类型包括不同的受体荧光标记。

14.在单分子水平对核酸分子测序的方法，其包含：

使包含未知核苷酸序列的核酸模板与测序组合物接触，所述组合物包含聚合酶、引物和对应所述聚合酶的单体，所述聚合酶具有与该酶上的位点连接的荧光供体，每一单体具有与其β-、γ-或末端-磷酸基连接的独特的荧光受体；

用来自激发光源的光激发荧光供体；

检测每一次掺入单体之时在聚合酶供体荧光标记与掺入单体上的荧光受体标记之间发生荧光共振能量转移(FRET)时发射的荧光；和

将单体掺入顺序读取为模板中相应的单体顺序。

15.权利要求14的方法，其中每一复制复合物的聚合酶、模板或引物固定在支持物上。

16.权利要求14的方法，其中复制复合物的聚合酶、模板或引物固定在支持物的区域，孔，槽，或通道中。

17.权利要求14的方法，还包含多个聚合酶、引物和模板以形成多个复制复合物，所述聚合酶具有与该酶上的位点连接的荧光供体。