[发明专利]表达辅酶A转移酶及β-酮基硫解酶的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌，具体地说是一种辅酶A转移酶及β-酮基硫解酶的表达工程菌，本发明还涉及该工程菌的构建方法，以及该菌在微生物生产乙酰乙酸盐中的应用。

背景技术

酮体(ketone bodies)是脂肪酸在肝脏进行正常分解代谢所生成的特殊中间产物，包括三种水溶性成分：乙酰乙酸(acetoacetic acid约占30％)，β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid约占70％)和极少量的丙酮(acetone)(Laffel L，Ketone bodies：a review of physiology，pathophysiology and application of monitoring to diabetes.Diabetes/metabolism research and reviews，1999，15(6)：412-426)，结构式及相互关系见图1。理论上讲，β-羟丁酸并不属于酮类，但它经常与其它两种物质伴随出现，因而统称为酮体。

正常人血液中酮体含量极少，这是人体利用脂肪氧化供能的正常现象。在某些生理情况(饥饿、禁食)或病理情况下(如糖尿病)，糖的来源或氧化供能障碍，脂动员增强，脂肪酸就成了人体的主要供能物质，以酮体的形式作为机体能量来源有着特殊的意义。但是，若肝中生成酮体的量超过肝外组织利用酮体的能力，二者之间失去平衡，血中浓度就会过高，导致酮血症(acetonemia)和酮尿症(acetonuria)。

乙酰乙酸(acetoacetic acid)是酮体的重要组成成分之一，是最简单的β-酮酸，为无色油状或浆状液体，或晶体，能与水、醇任意混合，是一种有机弱酸，pKa为3.7。分子量102.09g/mol，熔点36.5℃。结构式如式(I)所示

研究表明，乙酰乙酸及其衍生物有着重要的医用前景。目前，对乙酰乙酸及其衍生物的直接利用还很有限，但是，随着进一步研究的进行，对于乙酰乙酸及其衍生物的医学应用将越来越广泛。

与其他β-酮酸一样，乙酰乙酸很不稳定。它容易分解为丙酮和二氧化碳，反应式见式II。当乙酰乙酸以酸的形式存在时，在37℃水中它的半衰期为140min，而在碱性环境下(以阴离子形式存在)，半衰期为130h，比它的酸式降解速度慢50倍以上(Hay R W，et al.，Kinetics of decarboxilation of acetoacetic acid.Aust.J.Chem，1967，20(9)：1823-1828)。

CH₃COCH₂COOH→CH₃COCH₃+CO₂+H₂O  (II)

目前，主要通过乙酰乙酸乙酯在稀碱溶液中加热水解生成乙酰乙酸盐，然后酸化来制备乙酰乙酸(Robert C，et al.，CrystallineAcetoacetic Acid.Journal of the American Chemical Society，1952，74(21)：5536-5536)。但是由于乙酰乙酸盐不稳定，生产条件严格，所以工业上没有很好的生产方法。一般来说，乙酰乙酸的制备在0℃进行，制备后立即使用(George A.et al.，Methylglyoxal-ω-Phenylhydrazone.Organic Syntheses，1963，4：633)。

相对于纯化学途径合成有机物，用生物合成的方法具有一系列的优点，包括经济消耗低，对环境的污染少，反应条件宽松(37℃和标准大气压)等等。另外，化学方法生产乙酰乙酸需要强碱性环境，合成的强碱性产品不适于医疗应用，微生物方法是在中性偏碱的条件下合成乙酰乙酸，这显示出相对于化学合成巨大的优点。而且随着人们生活水平的提高，生物合成安全、副作用小的优点越来越受到重视。目前还没有利用微生物方法生产乙酰乙酸盐的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于表达β-酮基硫解酶和3-酮酸-辅酶A转移酶的专用表达工程菌。

为实现上述目的，本发明首先提供一种表达载体，其含有β-酮基硫解酶的基因(phaA)及3-酮酸辅酶A转移酶(scotAB)基因。所述表达载体是将β-酮基硫解酶的基因(phaA)及3-酮酸辅酶A转移酶基因(scotAB)克隆到表达载体中获得。