[发明专利]一种用于制备胰岛素化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过一步酶促反应从相应前体形式制备胰岛素化合物(包括它们的类似物或其衍生物)的方法，该方法包括组合并且同时使用适量的协同作用的胰蛋白酶和羧肽酶B，从而以可控方式指导反应以避免随机不希望副产物的产生。具体地，本发明所述的酶转化反应提供了以下优势：减少操作步骤的数目，所需最终产物的得率和纯度更高。

背景技术

基因工程方法逐渐使得能够在微生物中表达胰岛素的前体形式(EP-A-347 781、EP-A-367 163)。通常，通过化学和/或酶切割去掉前序列原(pre pro sequences)(DE-P-3 440 988、EP-A-0 264 250)。已知的酶转化方法是基于胰蛋白酶和羧肽酶B切割的(Kemmler W.等人，J.Biol.Chem.，246(1971)6786-6791；EP-A-195691；EP-B-89007)。在胰岛素前体分子转化为相应分子的典型过程中，除去了A和B链之间的接头肽(linker peptide)。胰蛋白酶的酶促反应是酶促的复杂反应，其不但切割在切割后会产生人胰岛素或所需最终产物的那些肽键，而且在竞争反应中还切割在切割后会产生多种不希望的副产物的其它敏感位点处的肽键。

现有技术的方法包括以在反应中将形成所需中间产物时加入第二酶羧肽酶的方式，使用胰蛋白酶和第二酶羧肽酶。这些方法的缺点在于形成了从反应溶液中难以除去的大量杂质副产物。在将人胰岛素前体形式转化为人胰岛素(人胰岛素，HI)的具体情况下，形成了大量des-Thr(B30)-人胰岛素(des-Thr(B30)-HI)。

根据上述内容，很明显以下情况将是有利的：采用更简单的酶促反应方法，通过能够尽可能完全除去可能形成的聚合物杂质并同时能够尽可能提高所需胰岛素最终产物浓度的更简单的步骤将前体胰岛素化合物、它们的类似物及其衍生物切割成胰岛素。需要额外的条件以确保高整体得率，从而提高操作的容易程度、所需最终产物的质量和数量。

已通过在本发明中所实施的酶促反应改善了已知方法的缺点，并且已证明在不希望副产物不增加的情况下，得率的提高与有益反应条件下所使用的胰蛋白酶和羧肽酶的最佳浓度有关。本发明人已试图开发了改善的一步酶促反应方法，其包括以最佳的量组合并且同时使用协同作用的胰蛋白酶和羧肽酶B以提供所需的最终产物，从而提高了操作的容易程度、最终产物的纯度和产率。

发明目标

本发明的主要目标是获得在形成最少的不希望副产物的情况下从相应前体制备胰岛素化合物及其类似物或衍生物的方法，该方法是通过一步酶促反应实现的，其包括组合并且同时使用协调作用的适量(最佳量)的胰蛋白酶和羧肽酶B以提供所需的最终产物。

本发明的另一个主要目标是提供SEQ ID 1、2、3、4、5、6、7和8所示的可以用作起始材料的胰岛素类似物前体，所述前体可以是液体或结晶形式。

本发明的另一个目标是提供用于表达胰岛素原或其类似物或衍生物的表达载体，所述表达载体包含编码前体分子的所述各DNA序列。

本发明的另一个目标是提供用所述表达载体转化并随后提供制备各胰岛素化合物的方法的适合微生物/宿主，其包括在适合的发酵培养基和发酵条件下培养所述转化的微生物以产生前体胰岛素形式。

本发明的另一个目标包括通过一步酶促反应将胰岛素化合物前体形式转化为它们各自的活性形式的方法，其中以允许协同并且受控反应一同加入适量的胰蛋白酶和羧肽酶，从而最少地产生不希望的终产物。

本发明的另一个目标是获得从各自前体对应物得到胰岛素或其类似物或其衍生物的方法，其包括按顺序而连续进行这些步骤。

本发明的另一个目标是获得胰岛素分子。

本发明的另一个目标是获得胰岛素分子，其选自包括胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛(glulisine)或IN-105的组。

发明内容