[发明专利]采用电子显微镜对核酸聚合物测序

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年10月4日提交的美国临时申请第60/997,427号和于2008年6月23日提交的美国临时申请第61/132,960号的优先权，本文通过参考特地并入其全部公开内容。

技术领域

本发明涉及核酸测序方法。

背景技术

目前，DNA测序大多通过Sanger法和其它合成测序方法来完成。这些方法的缺点在于成本高、阅读长度短和处理量不足。

已经对电子显微镜测序进行了探索。电子显微镜测序的想法并不新。它在DNA结构被发现仅6年后就由Richard Feynman提出。然而，尚未将其成功用以产生有意义的序列信息。

透射电子显微镜(TEM)通过将电子束穿过样品送至检测器或屏幕上而工作。样品中的部分阻碍或反射电子束，从而到达检测器的电子图案形成图像。在多数情形中，低原子数(Z)的原子产生极小的反差并且在电子显微镜中基本不可见。包含低Z的氢、碳、氮、氧和磷原子的普通DNA在电子显微镜下几乎不显示出反差，并且几乎不可能在承载背景下显现。为了使用现有电子显微技术使DNA可视化，可以用高Z原子标记碱基或使得其可由TEM检测。

最初的严肃的电子显微镜测序研究由Beer，M.和Moudrianakis，E.N.，48(3)PNAS 409-416(1962)进行。他们的最初研究集中于DNA的重原子标记和试图使重原子在电子显微镜下可视化。后来的研究且可能是迄今最佳的其它研究由Whiting和Ottensmeyer进行。据Ottensmeyer报道：“开发了腺嘌呤和鸟嘌呤的重原子标记物并在模型序列上进行了尝试，结果仅表明虽然电子显微镜和化学不再是主要障碍，但样本制备仍然是主要障碍。标记的单链核酸聚合物在样本载体上的不可控安置造成相当不规则的碱基与碱基间距。因此，无法从单个分子的容易且精确地进行阅读。”(Ottensmeyer，F.P.(1979)″Molecular Structure Determination by High Resolution ElectronMicroscopy″Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9129：129-144(略去内部参考文献))

对个体基因组和其它序列进行快速测序的能力对于生物医学极具重要性，且如上所述，需要改进的方法。

发明内容

本发明提供了使用电子显微镜通过直接检视来对标记的拉伸的核酸如DNA进行测序的方法。本发明的方法、装置和组合物使得能够可控地将核酸置于基片上从而具有恒定的碱基与碱基间距，这使得能够使用电子显微镜获取准确的核酸序列信息。本发明可以以多种方式实施。

根据本发明的一个方面，DNA聚合链的序列信息的获取方法可以包括：提供包含所述DNA聚合链的溶液，其中已对所述DNA聚合链进行处理从而已用具有碱基特异性或碱基选择性的造影剂将多个DNA碱基标记；将DNA结合工具引入所述溶液并使所述DNA聚合物的一部分与该工具结合；将所述工具从溶液中除去；将标记的DNA聚合链在空间内拉伸从而使该标记的DNA聚合链悬挂于空气/溶剂界面与所述工具之间；将经拉伸的标记DNA聚合链沉积于基片上；使用电子显微镜使标记的DNA聚合链成像由此确定经标记的碱基和未经标记的碱基的位置；和将经标记的碱基和未经标记的碱基的位置与DNA聚合物的序列进行相关。

所述方法还可包括使DNA链变性以便在用造影剂进行标记之前产生单链DNA的步骤。变性步骤通过热变性或化学变性进行。所述方法还可以包括在所述成像步骤之前将碳层沉积于与基片相连的DNA聚合链上方。所述方法还可以包括用不同标记对来自DNA聚合物样品的多个链进行标记并汇集从该DNA聚合物的多个链的成像获取的数据以便获得完整序列信息。

DNA可以为大于约100kb的高分子量DNA。拉伸步骤可能在DNA聚合链中产生恒定的碱基与碱基间距。碱基之间的碱基与碱基间距可以为约～约且特别是约DNA聚合链可以被拉伸至至少约2μm的长度。

可以仅对DNA聚合链的碱基的子集进行标记。碱基子集包括胸腺嘧啶和胞嘧啶。碱基子集包括腺嘌呤和鸟嘌呤。