[发明专利]人胚胎干细胞的分化

说明书

技术领域

本发明提供促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。具体地讲，本发明提供形成胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改进方法。此外，本发明还提供在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。本发明还提供在衍生自多能干细胞的胰岛素产生细胞中促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的方法。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的一组细胞。诸如例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA4、Mixll、CXCR4和Sox-17。

多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述的(Vector Laboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。

通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。或者，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。

例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等人(Science，1998年11月6日：第282卷，第5391期，第1145-1147页)公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人胚泡的多能干细胞系。

Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)对一组11种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养的能力进行了评价。Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系保持了人胚胎干细胞形态并保持了多能性”。

US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。

又如，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了用于人多能干细胞在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。

又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了一种衍生自人胚胎干细胞的自发分化的饲养细胞系统。

在另一例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞的来源。

Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了衍生自人包皮的饲养细胞层。

又如，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。

US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声 称：“本发明包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培育干细胞的方法”。