[发明专利]检测核酸的装置和方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于检测核酸，例如用于分子诊断的方法和设备，例如生物传感器。

发明背景

磁性颗粒在核酸检测方法中是用途是公知的。例如，WO2006131892描述了在其中扩增核酸的磁性生物传感器。在扩增期间，磁性颗粒掺入到扩增的DNA中。扩增的核酸随后利用掺入的磁性颗粒来检测。检测方法涉及在传感器表面附近磁性颗粒的结合。在传感器表面附近的结合是通过目标与附着到传感器表面的探针的结合来实现的。在这些方法中，必需添加严格的步骤来获得对探针/目标相互作用的高灵敏性和特异性。这一般涉及改变温度和/或缓冲条件。

现有技术提出了在固体表面上的杂化分析，其中信号产生在核酸酶的作用下被控制(WO03052139、WO02059364)。在这些公开物中，描述了一些方法，其中核酸目标/探针杂化物被酶裂解，引起可检测信号的分离。这样的酶裂解步骤使得该分析更为选择性和更严格。选择对某些碱基序列为选择性的酶的可能性进一步提高了检测的特异性。在某些情况下，甚至可以检测到单个核苷酸错配(例如，SNP)。WO02059364提出了磁性颗粒作为标记物的用途。

现有技术的分析具有几个缺点，它们是在反应表面附近或反应表面上进行检测的结果。在酶消化之后需要洗涤步骤，来确保低背景信号和消除假阳性。虽然可能等待裂解的标记物扩散远离表面，但这显著地提高了得到结果的时间。在涉及快速检测的应用中，过程步骤的数量的减少是期望的。第二，由于标记物附着到表面，可测量的浓度的动态范围与在总(bulk)体积中产生信号的同质的分析相比会是有限的。

另外，存在着很少的方法，其容许从目标产生的信号的扩增而不扩增目标本身或添加更多标记物。这些方法对于低浓度的核酸目标的检测是有益的，而不会扩增这种目标。

具有核酸酶活性的核酸(DNAzymes)已经用于在扩增期间核酸的定量实时检测。在同质阶段，Qzyme探针(Clontech)采用DNAzymes通过供体和接受体染料之间的拴系物的酶裂解来控制光的产生。染料还已经与金纳米粒子组合作为探针中的淬灭剂。这些探针的检测利用包括荧光和比色方法的方法光学地进行。这些定量性的方法需要探针和染料标记物的复杂的设计。

发明概述

本发明公开了基于磁性或可磁化颗粒的操作检测核酸目标的方法，所述磁性或可磁化颗粒从探针上朝向传感器表面释放。这种释放是裂解酶的作用的结果。这些方法可以应用于例如核酸的定量检测。它们可以任选地与扩增技术(例如，PCR)组合。

本发明的特别的和优选的方面在附随的独立和从属权利要求中列出。从属权利要求的特征可以视情况与独立权利要求的特征以及与其他从属权利要求的特征组合，不仅仅是如权利要求中明确阐述的。

本发明的一个方面涉及检测样品中目标核酸分子(1)的方法。最特别地，本发明涉及一些方法，其组合了通过磁场移动的磁性颗粒的使用和核酸特异性酶的作用。在特定的实施方式中，提供了检测样品中的目标核酸分子(1)的方法，其包括步骤：

a)提供了与目标核酸分子(1)互补的核酸探针(2)，其中所述探针(2)与磁性或可磁化颗粒(3)连接，并附着到表面(4)

b)在容许所述探针(2)与所述目标核酸(1)的结合的条件下使所述样品与所述探针接触，从而形成探针/目标杂化物，

c)施加或活化核酸裂解酶(E)，其区别未结合的探针和结合的探针/目标杂化物，

d)至少在步骤(c)期间，施加磁场(F)以操作未结合的磁性或可磁化颗粒朝向远离所述表面的区域，

e)在一个或更多个时间点检测在所述表面(4)上磁性或可磁化颗粒的浓度和/或在远离所述表面的所述区域中磁性或可磁化颗粒的浓度，

在特定的实施方式中，在所述表面处和/或在远离所述表面的所述区域中的检测通过测量所述磁性或可磁化颗粒的磁场来进行。

在进一步的实施方式中，在所述表面处和/或在远离所述表面的区域中磁性或可磁化颗粒的检测是通过FTIR(frustrated total internalreflection，受抑全内反射)进行的。

在进一步特定的实施方式中，在所述表面处和/或在远离所述表面的区域中磁性或可磁化颗粒的检测通过测量附着到所述磁性或可磁化颗粒的可检测标记物来进行。

在特定的实施方式中，在本发明的上下文中使用的磁性或可磁化颗粒是包含磁性材料和荧光标记物的颗粒。

在特定的实施方式中，本发明的方法利用了核酸裂解酶，其至少裂解所述探针/目标杂化物中的所述探针。