[发明专利]来自艰难梭菌的新型多糖免疫原

说明书

本申请涉及新型免疫原性细胞表面多糖及其方法和用途。

发明背景

艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种革兰氏阳性细菌，已知它是肠道疾病的病因。它是抗生素相关性腹泻和假膜性结肠炎的主要病因(Knoop，F.C.；Owens，M.；Crocker，I.C.；Clin.Microbiol.Rev.6，1993，251-265)。与艰难梭菌相关的暴发流行的频率和严重性近年来有所增加(Pepin，J.；Valiquette，L.；Alary，M.E.；Villemure，P.；Pelletier，A.；Forget，K.；Pepin，K.；Chouinard，D.；JAMC.171，2004，466-472)。大多数被摄入的有生长力的艰难梭菌细胞都被胃中存在的酸性环境杀死。然而，孢子能幸免于此，并且在曝露于胆汁酸后，可以在小肠中萌发。由于药物治疗诸如抗生素的使用和化学疗法而造成的肠道中正常微生物细胞水平的降低可使艰难梭菌繁殖。

在人类中，艰难梭菌相关的腹泻(CDAD)是医院相关性腹泻和抗菌剂相关性腹泻最常见的诊断病因。传统上，老年患者和已接受住院治疗、胃肠道外科手术或接触抗生素的患者罹患CDAD的风险较高。在美国，估计的艰难梭菌相关的疾病的病例数量每年超过250,000(Wikkins TD和LyerlyDM，2003，J.Clin Hosp Infect.48：81)，全部的附加卫生保健费用接近每年十亿美元(Kyne L等人，2002，Clin Infect Dis 34：346-353)。

在过去五年中，已经观察到CDAD发病率出乎意料地增加。这还涉及较高比率的严重CDAD、治疗失败和死亡。在年轻患者和无传统风险因素的患者中，更频繁地鉴定出重症患者。大部分这种变化与称为核糖核酸型(ribotype)027(也称为北美去氧核糖核酸型(pulsotype)1(NAP1)和BI)的暴发克隆的世界性传播有关。艰难梭菌的预防基于患者隔离、改进卫生设施、改进感染控制和抗菌剂限制，所有这些都涉及高的医疗保健费用。此外，抗生素的预防性使用已经用于预防感染；然而，这导致疾病的发病率增加。由于对甲硝唑(主要的第一线治疗药物)的反应正在变得不可预知，艰难梭菌感染的治疗也成问题。万古霉素(替代的选择)很昂贵并且它的使用引起有关出现抗万古霉素肠球菌和其它抗万古霉素生物体的忧虑。

CDAD在许多动物物种诸如马和猪中也是重要的问题。它还可以成为其它物种的病因。有一个担忧是，艰难梭菌可以从动物传播到人，因为从动物分离出的艰难梭菌的类型经常与在人中发现的类型相同，包括暴发菌株核糖核酸型027。根据在零售肉样品中发现艰难梭菌，这种担忧已经加剧。

报导的CDAD在增加的发病率、其再发率和其对发病率和死亡率的影响，以及有关治疗和为限制其传播而进行的适当的隔离操作的费用，使得对有效的CDAD预防方法的需要变得清晰。

一个称为核糖核酸型027或NAP1的具体菌株，已经成为国际上散发病和流行病的重要病因。已经报导了具有高发病率、高死亡率、治疗反应性差、高复发率的严重暴发流行。该菌株产生3种主要毒素：毒素A、毒素B和CDT(二元毒素)。它还缺失号称的毒素调节基因，该缺失似乎至少在体外增加了毒素的产生(Just，I.；Selzer，J.；Wilm，M.；von Eichel-Streiber，C.；Mann，M.；Aktories，K.；Nature.375，1995，500-5033)。人们发现，该产芽孢细菌通过细胞表面多糖抵抗吞噬作用。

Poxton和Cartmill(Poxton，I.R；Cartmill；T.D.J Gen Microbiol.1982，128，1365-1370)描述了从艰难梭菌菌株NCTC 11223提取的两种制剂的糖组成。观察到，通过用NaOH处理细胞得到的物质含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖胺和磷酸酯和其它，通过用苯酚处理细胞提取的物质含有葡萄糖、葡糖胺、磷酸酯和脂肪酸。在同一工作中，还观察到，两种制剂都与污泥梭状芽孢杆菌(Clostridium sordellii)抗血清发生交叉反应。

人们越来越需要开发抗艰难梭菌感染的人类疫苗和动物疫苗，以便预防CDAD或预防复发。此外，需要对动物接种疫苗以便预防动物疾病并减少艰难梭菌的散发(shedding)以便降低动物传染病传播的风险。

发明概述

本申请公开了新型艰难梭菌细胞表面多糖，包括它们的共价化学结构，这些新型多糖用于免疫原性组合物、抗艰难梭菌疫苗制剂和/或用作诊断标记。