[发明专利]纯化或检测靶蛋白的方法

说明书

发明领域

本发明涉及纯化和检测蛋白质的领域。具体地，本发明涉及使用适体特异性地纯化或检测介质(特别是溶液)中的目的蛋白，在所述介质中也可能包含与目的蛋白同源的蛋白。

背景技术

用于纯化和检测目的蛋白(也可被称为“靶蛋白”)的方法通常包括将可能包含目的蛋白的待测介质与能结合所述目的蛋白的化合物接触的步骤。可结合靶蛋白的这些化合物可具有各种性质。它们可以是(i)包含具有与蛋白结合的性质的化学基团的有机化合物(例如DEAE、季铵、烷基链、硅烷醇)；(ii)或蛋白(例如抗体)、糖胺聚糖(肝素)、染料(汽巴蓝F3GA)或核酸(例如适体)。

用于纯化或检测靶蛋白的方法的有效性依赖于例如结合靶蛋白的化合物的亲和力和特异性。

对于某些具有复杂组成的起始介质，尤其是包含很多不同蛋白质的起始溶液，纯化和检测目的靶蛋白仍很困难。当在复杂的起始介质中待纯化或检测的靶蛋白与一种或多种不同但彼此高度同源的蛋白共存时，这尤其是事实。实际上，当靶蛋白和一种或多种与这种靶蛋白同源的蛋白存在于溶液中时，开发通过使用常规纯化或检测方法能高水平地区分感兴趣的靶蛋白与不需要的同源蛋白的纯化或检测工具变得困难。即使抗体——已知它们对靶蛋白具有高特异性，也常常遭遇交叉反应，包括与很多和靶蛋白具有结构同源性的蛋白的交叉反应。

难于特异性地纯化或检测彼此同源的蛋白质的这种困难是许多应用领域中的缺陷，包括目的在于特异地研究靶蛋白(不管是否将与靶蛋白潜在同源的任何其它蛋白质)的学术研究领域，以及工业领域中，例如为了开发新的更有效的纯化或检测工具，以便与已知的纯化或检测工具相比和管理或行政要求更为相容。

当蛋白以重组形式(本文中称为转基因蛋白)在天然也表达所述转基因蛋白的同源蛋白的转基因生物或微生物中产生时，难于特异性地纯化或检测彼此同源的蛋白质的困难就会出现。这尤其包括，从固有地在其基因组中具有所谓的“直系同源”基因(编码与转基因编码的重组蛋白高度同源的蛋白)的生物中获取重组蛋白时的情况。

在转基因动物中表达的人或动物转基因蛋白常常与在该转基因动物中天然表达的内源性蛋白同源。在应该避免转基因蛋白与该天然的内源性同源蛋白的共提取或共检测的情况下，该天然内源性同源蛋白的产生构成一个技术问题。

当转基因重组蛋白是待用于制备药物的治疗性蛋白时，重组蛋白纯化制品中存在的任何与该转基因蛋白同源的内源性蛋白都可能在服用该药物的患者中产生不想要的副作用，包括诱导对该污染性天然蛋白的不想要的免疫应答，这种免疫应答可能损害医学治疗的有效性，并且甚至有时会导致可能对患者健康潜在有害的自身免疫反应。随着在转基因动物中生产的治疗性转基因蛋白的越来越多的使用，这些问题也越来越多地出现。因此，为了获得高度安全的治疗性产品，应当特异性地纯化转基因蛋白，使之存在非常少量的不想要的同源蛋白，并且如有可能，完全缺乏不想要的同源蛋白。确实，用于检测感兴趣的靶蛋白的方法应该是特异的、敏感的和有效的。

根据称为SELEX的方法选择的RNA型适体(单链核糖核酸分子)，可与目的蛋白特异地结合。在Liu等，RNA aptamers specific for bovinethrombin(对牛凝血酶有特异性的RNA适体)，J.Mol.Recognit.，2003：16，23-27中，作者给出了与牛凝血酶结合但不与人凝血酶结合的RNA型适体。尽管单独地该文献显示通过SELEX法可以选择能辨别溶液中的同源蛋白质的高特异性RNA适体，但是至今为止尚无文献描述过使用高特异性适体区分同源蛋白的工业方法。

高特异性适体的使用带来了很多技术问题。首先，适体通过SELEX法在溶液中选择。为了适用于纯化或检测法，适体应该被固定在固相支持体上。有很多出版物显示，当适体被固定化时，适体的结合性质(亲和力、特异性......)会受到损害。此外，RNA型适体-在现有技术中描述的唯一高特异性适体类型——是非常不稳定的分子，其在室温会发生改变。因此，RNA适体与工业纯化或检测方法并不相容。化学修饰的RNA可能是一个可选方式，但是此类分子的目前合成成本无可争议地与工业规模应用不相容。

因为抗体对目的蛋白的强亲和力以及它们的相对高特异性，抗体被广泛地用于蛋白质的纯化和检测方法中。