[发明专利]微生物浓集方法和试剂

说明书

优先权声明

本申请要求2007年10月3日提交的美国临时申请号60/977,200 的优先权，藉此将该申请的内容以引用方式并入申请。

技术领域

本发明涉及用于捕集或浓集微生物使得它们保持活力以便检测或 测定的方法。在其他方面，本发明还涉及用于实施所述浓集方法的浓 集剂(及其制备方法)和诊断试剂盒。

发明背景

由微生物污染导致的食源性疾病和医院内获得性感染为世界各地 关注的问题。因此，测定各种诊断样品、食品样品、环境样品或其他 样品中细菌或其他微生物的存在以确定所存在的微生物的身份和/或量 常常是合乎需要的或是必要的。

例如，可测定细菌DNA或细菌RNA，以甚至在存在其他细菌种 类的情况下评估特定细菌种类的存在与否。然而，检测特定细菌的存 在的能力至少部分取决于被分析的样品中细菌的浓度。可对细菌样品 进行铺板或培养，以增加样品中细菌的数量，来确保足够的检测水平， 但培养步骤通常需要大量的时间且因此会明显耽搁评估结果。

使样品中的细菌浓集可缩短培养时间或甚至消除对于培养步骤的 需要。因此，已经开发了通过使用特定细菌菌株的特异性抗体(例如， 为抗体包被的磁性颗粒或非磁性颗粒的形式)来分离(并由此浓集) 该菌株的方法。然而，这些方法往往昂贵，而且对于至少一些诊断应 用来说速度仍比期望的稍慢。

也已经使用了非菌株特异性的浓集方法(例如是对样品中存在的 微生物作较为一般性的评估)。在浓集了微生物混合群体之后，如果 需要，可通过使用菌株特异性探针来测定特定菌株的存在。

已经通过基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法实现了微 生物的非特异性浓集或捕集。涂覆壳聚糖的支持物已经被用作非特异 性捕集装置，并且用作微生物营养素的物质(例如，碳水化合物、维 生素、铁螯合的化合物以及铁载体)也已经被描述为可用作配体以进 行微生物的非特异性捕集。

多种无机材料(例如，羟基磷灰石和金属氢氧化物)已经用于非 特异性结合和浓集细菌。物理浓集方法(例如，过滤、色谱、离心和 重力沉降)也已经用于非特异性捕集，其使用和/或不使用无机结合剂。 这些非特异性浓集方法在速度、成本(至少一些需要昂贵的设备、材 料和/或受过训练的技术人员)、样品要求(例如，样品性质和/或体积 限制)、空间要求、使用的方便性(至少一些需要复杂的多步骤方法)、 现场使用的适合性和/或效果方面不同。

发明内容

因此，我们认为迫切需要用于快速检测病原微生物的方法。所述 方法将优选不仅快速而且成本低、简单(不涉及复杂的设备或程序) 和/或在多种条件下(例如，不同类型样品基质、不同细菌负荷以及不 同样品体积)有效。

简而言之，在一个方面，本发明提供了一种用于非特异性浓集样 品中存在的微生物菌株(例如，细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病 毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)和细菌内生孢子的菌株)使得微 生物保留活力以便检测或测定一种或多种菌株的方法。所述方法包括： (a)提供浓集剂(优选粒状浓集剂)，所述浓集剂包含在其表面的至少 一部分上带有表面处理的硅藻土，所述表面处理包括表面修饰剂，所 述表面修饰剂包括二氧化钛、微微细纳米级金或铂，或它们的组合；(b) 提供包含至少一种微生物菌株的样品(优选流体形式)；以及(c)使所 述浓集剂与所述样品接触(优选通过混合接触)，使得所述至少一种 微生物菌株的至少一部分被所述浓集剂结合或捕集。优选地，所述方 法还包括检测所述至少一种结合的微生物菌株的存在(例如，通过基 于培养的检测方法、显微镜法/成像检测方法、基因检测方法、基于生 物发光的检测方法或免疫检测方法)和/或离析(优选地，通过重力沉 降)所得的结合微生物的浓集剂。所述方法还可任选包括将所得的离 析的浓集剂与样品分离。

本发明的方法不靶向特定的微生物菌株。相反，已经发现，某些 较便宜的无机材料可令人惊讶地有效捕集多种微生物。这类材料可以 以非菌株特异性方式浓集存在于样品(例如，食品样品)中的微生物 菌株，使得可较容易且快速地测定一种或多种微生物菌株(优选地， 一种或多种细菌菌株)。