[发明专利]具有单读出的通用激酶/磷酸酶测定法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测激酶或磷酸酶活性的通用测定法及其在生命科学和药物发现中的用途。

背景技术

在最近数年中，已经开发出用于体外药理学和高通量筛选(HTS)的检测肽或蛋白的磷酸化(激酶活性)或去磷酸化(磷酸酶活性)的数种方法。对于这些应用而言，最吸引人的是具有荧光读出(readout)的检测方法，它们为匀相的、混合并度量的测定法，因此适用于微型化。常用测定法基于特异性抗体与磷酸基团的结合，但是由于针对磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的抗体是序列特异性的，所以基于抗体的测定法不是通用性的。基于固定化金属离子亲和力的测定法(IMAP)是无需抗体的，因此是通用性的。另一种用于检测激酶活性的通用测定法是测量ADP产量的Transcreener测定法。在所有这些测定法中，激酶/磷酸酶活性的检测是基于荧光偏振(FP)或荧光能量共振转移技术(FRET、TR-FRET、HTRF)。

但是，这些荧光测量法需要有关不同光参数的多个读出，所述光参数例如偏振、波长、延时型检测(需要更复杂的仪器操作而不是简单的荧光强度测量)。ADP测定法仅适用于高ATP/ADP浓度和高转换的酶，并且可能很容易跑出线性的反应范围。而且，这种检测仅仅是间接的，因为监控的是ATP/ADP消耗，而这种消耗可能不是特异性的，不是特定磷酸酶或激酶底物的(去-)磷酸化。

因此，需要改良的通用激酶和磷酸酶测定法，其允许激酶或磷酸酶活性的有效检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于检测激酶活性或磷酸酶活性的方法，其通过稳健且可靠的荧光读出实现这种需要。

该方法包括以下步骤：

a)孵育激酶或磷酸酶活性样品与包含具有可检测读出的荧光团的激酶或磷酸酶底物分子，

b)孵育步骤a)的混合物与包含芳族基的检测实体和结合配偶体(binding partner)，其中磷酸化底物分子和检测实体能与结合配偶体结合，并且底物分子和检测实体与结合配偶体的结合产生改变的荧光团读出，和

c)测量步骤b)的混合物中的荧光团读出，其中与空白相比改变的荧光团读出指示样品中激酶或磷酸酶活性的存在。

第二目的，本发明涉及用于检测激酶活性或磷酸酶活性的方法。所述方法包括以下步骤：

a)孵育激酶或磷酸酶活性样品与包含芳族基的底物分子，

b)孵育步骤a)的混合物与包含具有可检测读出的荧光团的检测实体和结合配偶体，其中磷酸化底物分子和检测实体可与结合配偶体结合，并且底物分子和检测实体与结合配偶体的结合产生改变的荧光团读出，和

c)测量步骤b)的混合物中的荧光团读出，其中与空白相比改变的荧光团读出指示样品中激酶或磷酸酶活性的存在。

在本发明的一个实施方案中，荧光团选自由荧光素(Fluorescein)、罗丹明B(Rhodamine B)、四甲基罗丹明(Tetramethylrodamine)、ATTO 590、ATTO 655、ATTO 680、Atto 700、MR 121、Bodipy 630/650和Bodipy FL组成的组。优选的荧光团选自由MR 121、ATTO 590、ATTO 655、Atto 680和ATTO 700组成的组。用于本发明方法的特别优选的荧光团是MR 121和Atto 700。这些荧光团中的一些的分子结构可在Bioconjugate Chem.2003，14，1133-1139中发现。ATTO分子可商业得自Atto-Tec GmbH，Siegen，Germany。

在本发明的一个实施方案中，芳族基选自由具有芳族系统的氨基酸组成的组，优选色氨酸。用于本发明方法的其他适合的芳族基选自如cGMP或cAMP衍生物的分子。

底物分子优选为包含至少一个酪氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的肽。

在另一个实施方案中，该方法用于检测酪氨酸激酶活性且底物肽包含至少一个酪氨酸。

在又一个实施方案中，该方法用于检测丝氨酸激酶活性且底物肽包含至少一个丝氨酸。

在又一个实施方案中，该方法用于检测苏氨酸激酶活性且底物肽包含至少一个苏氨酸。

在进一步的实施方案中，该方法用于检测磷酸酶活性且底物分子为包含磷酸基、优选磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的肽。

在进一步的实施方案中，该检测实体为包含磷酸酪氨酸和/或磷酸丝氨酸和/或磷酸苏氨酸的肽。