[发明专利]利用酶促反应合成样品中的cDNA的方法

权利要求书

1.一种在酶反应中合成样品的cDNA的方法，该方法的特征在于包括 以下步骤：

a.提供反应混合物，所述反应混合物中同时提供具有末端转移酶活性的第 一种酶，具有反转录酶活性的第二种酶，缓冲液，至少一种核糖核苷酸，含有 dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核糖核苷酸的混合物，锚定寡核苷酸以及 扩增产生的cDNA的酶及试剂，其中，所述锚定寡核苷酸选自聚腺苷酸寡核苷 酸、聚(C)寡核苷酸、聚(T)寡核苷酸、聚(G)寡核苷酸、聚(U)寡核苷酸、额 外包含5′-尾的聚腺苷酸寡核苷酸，额外包含5′-尾的聚(C)寡核苷酸，额外 包含5′-尾的聚(T)寡核苷酸，额外包含5′-尾的聚(G)和额外包含5′-尾的聚(U) 寡核苷酸；

b.将包含核糖核酸的样品加到所述反应混合物中，

c.在一个或多个温度步骤中温育步骤a)和b)的物质，所述温度步骤的选择 应使得所述第一种酶和所述第二种酶显示活性，然后扩增在该方法中如此产生 的cDNA。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应还包括65℃-95℃的 较高温度的至少一个温度步骤。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，随后采用聚合酶链式反 应扩增该方法中产生的cDNA，该反应包含随机引物和/或特异性引物，和任选 含有一种或多种探针。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端转移酶活性是聚腺 苷酸化活性。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品包含核糖核酸， 其选自下组：原核生物RNA、真核生物RNA、病毒RNA、太古细菌-RNA、 miRNA、snoRNA、mRNA、tRNA、非聚腺苷酸化的RNA、和rRNA，以 及它们的混合物。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述锚定寡核苷酸的长 度通常介于6-150个核苷酸之间并且任选在3’-端具有锚定序列。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述锚定寡核苷酸是脱氧 核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸-脱氧核糖核酸、 环己烯-核酸(CeNA)、N3′-P5′-亚磷酰胺(NP)、或三环-脱氧核糖核酸 (tcDNA)。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述核糖核苷酸选自下 组：腺苷-5′-三磷酸、胸苷-5′-三磷酸、胞嘧啶-5′-三磷酸、鸟嘌呤-5′-三磷酸、 尿嘧啶-5′-三磷酸，其中所述核糖核苷酸任选经修饰或作标记。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸选自下 组：脱氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)、脱氧胸苷-5′-三磷酸(dTTP)、脱氧胞嘧啶 -5′-三磷酸(dCTP)、脱氧鸟嘌呤-5′-三磷酸(dGTP)、脱氧尿嘧啶-5′-三磷酸 (dUTP)，其中所述脱氧核糖核苷酸可任选经修饰或作标记。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸的标记 物选自下组：放射性标记物；荧光染料；香豆素；苯甲亚胺；菲啶；吖啶类 染料；咔唑染料；吩嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料；花青苷染料；BODIPY 染料；喹啉染料；和Alexa染料。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸的标记 物选自下组：生物素、洋地黄毒苷和半抗原。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述反应中脱氧核糖核苷 酸的浓度范围是0.01mM到10mM。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸dATP、 dCTP、dGTP和dTTP各自存在的浓度为0.2mM-2mM。

14.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为6-10 并包含Mg²⁺离子。