[发明专利]电化学检测核酸序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过电化学方法检测核酸杂交的方法。更具体地说，本发明涉及一种检 测特定DNA序列、在所述序列中错配的存在以及其位置的方法，所述方法基于使用来 源于通式(I)的钌的化合物作为电化学生物传感器中杂交的指示剂。

背景技术

基于短DNA序列分析的分子诊断提供了敏感且定量的方法来进行病原体导致的感 染性疾病的早期诊断(Grag，S.K.等人，Clin.Lab.Anal.2003，17(5)，155-163；Vernet，G. Virus Res.2002，82(1-2)，65-71)。

DNA杂交是最常用的分析和检测核酸中一个特定基因或片段的方法。在这些基于 杂交的方法中有些是基于表面等离子共振(Mullet，W.M.等人，Methods 2000，22，77-91； Sawata，S.等人，Bioelectron.1999，14，397-404；Livache，T.等人，Synth.Met.2001，121， 1443-1444；Wood，S.J.Microchem.J.1993，47，330-337)、荧光(Piunno，P.A.E.等人，Anal. Chim.Acta，1994，288，205-214；Fodor，S.等人，Science，1991，251，767-773)、重量分析 (OKAHATA，Y.等人，Am.Chem.Soc.1992，114，8299-8300；Minnuni，M.等人，Anal.Chim. Acta，2003，481，55-64)或放射性同位素标记(Séller，G.H.等人，DNA Probes，2nd ed. StocktoonPress：New York，1993；pp 149-213)。最常使用的方法是使用放射性同位素标记 的DNA或RNA片段，即探针。事实上，此方法是受控的DNA扩增即PCR(聚合酶链 反应)的基础，PCR用于DNA克隆和测序。

在基于杂交的方法中，DNA生物传感器与上述方法相比具有优点。这些方法的其 中一个优点是能够开发出简单轻便的装置来进行此类诊断。此外，这些DNA生物传感 器和PCR扩增技术的结合可以使核酸序列检测具有高灵敏性(Meric，B.等人，Talanta 2002，56(5)，837-846)。使用固定在表面上的荧光标记的寡核苷酸开发出了用来分析特定 DNA序列和基因表达的高密度DNA芯片。但是，这些方法需要标记靶DNA(Berre，V.L. 等人，Nucleic Acids Res.2003，31，e88；Dolan，P.L.等人，Nucleic Acids Res.2001，29， 107)。

由于DNA具有电活性核酸带(nuceic bands)，因此根据此性质还开发了电化学检 测系统以直接检测杂交的DNA而不需标记物介入(Park，S.等人，Science，2002，295， 1503-1506；Drummond，T.G.等人，Nat.Biotech.，2003，21，1192-1199)。DNA一般固定在一 个电极上，在杂交前后检测的电流的差异与固定在电极上的DNA的数量有关 (WO93/20230)。但是，这种没有标记物的直接检测非常不灵敏。

为了提高灵敏度的目的，开发了不同的使用电活性探针分子或电活性标记物的方 法。因此，Palanti等人(1996，Analytical Letters，29，pp.2309-31)描述了不同的电活性化合 物，这些电活性化合物可与DNA相连且因此可通过氧化还原提供电势给电极而被检测。 因此可使用过渡金属复合物、抗生素、吖啶或苯甲酰胺染料和其他DNA嵌入试剂。

由于这些电活性探针或标记物比DNA具有更好的氧化还原性质，它们的使用可获 得更高的信噪比和更好的灵敏性。