[发明专利]荧光焦点调制显微系统和方法

说明书

技术领域

本发明总体地涉及光学显微镜，更具体地涉及荧光共焦光学显微 系统和方法。

背景技术

已经开发多种光学显微镜，并且在现代生物研究和临床诊断中已 经使用了这些光学显微镜。常常需要这些光学显微镜来观察细胞及其 亚细胞结构。作为现代细胞生物学的起源，在300多年以前开始发现了 细胞，这是发明显微镜的直接结果。传统的光显微镜具有非常有限的 成像深度。仅有表面显微结构能够被观察，或者需要将样品机械地分 割为非常薄的切片(slice)。作为光学层析能力(optical sectioning capability)的结果，如美国专利No.3013467中所描述的共焦显微术的 发明导致成像深度的飞跃。用生物组织可以实现至多200微米的穿透深 度(penetration depth)。共焦显微镜通常用荧光染料工作，以提供 分子敏感性(sensitivity)和特异性。通过使用荧光分子的多光子激发， 成像深度可以进一步被提高到大约700微米。然而，多光子显微镜需要 使用昂贵的脉冲激光器。另外，脉冲激光输出可以对活体细胞产生非 线性光子诱导破坏，对于人体的应用尤其不希望这样。

从微观尺度到宏观尺度，生物组织是非均质的(heterogeneous)。 通常，由于光子经受强散射和吸收，所以这些生物组织似乎对于可见 光和近红外光不透明。散射，尤其是多次散射，在改变光子的传播方 向的成像科学中是不希望的现象。妨碍共焦显微镜看见生物组织内的 更深处的主要问题是多次散射。可以扩散到焦点体积(focal volume) 的从焦点区域发出的荧光不能被共焦针孔(confocal pinhole)充分地 拒斥，从而有助于背景信号。信号背景比(signal to background ratio) 和空间分辨率随着深度增加而快速地劣化。散射平均值自由程/s，即 连续的散射事件之间的平均距离，在人的软组织中的典型值为大约100 微米。虽然传统的宽场显微术仅仅能够处理非常薄的样品，但是由于 提供光学层析能力，所以共焦显微术的发明在现代光显微术中是一个 显著的进步。在共焦显微镜中，用聚焦的光束照射样品，对样品逐点 进行扫描，并且通过使用共焦针孔，将检测系统聚焦到样品中的同一 区域。在理想的情况中，在收集来自焦点的信号的同时，来自样品的 离焦光(out-of-focus light)大部分地被拒斥。然而，在焦点移动到样 品中的散射光子占弹道光子(ballistic photon)中的主导的这样深度 时，这种选择检测机制不是如此有效。确定空间分辨率的点扩展函数 随着成像深度的增加而在空间中快速地扩宽。虽然在几个/_s的深度可以 检测到强目标，但是即使在目标位于离表面的仅一个/_s处时，通过背 景信号也可以容易地掩盖高分辨率细节。通常用共焦显微镜在几十个 微米的最大成像深度处执行亚细胞成像。

在多光子显微术中，在小于1皮秒的超短时间窗内将聚焦的照明 光束进一步会聚。非线性吸收率在离焦时急剧地衰减，并且，在成像 深度小于1mm时，这种选择激发方法是有效的。作为提高了的成像深 度和局部化的光化学(localized photochemistry)的结果，多光子显 微术已经日益成为对共焦显微术的流行的另一种选择。然而，多光子 显微术是使用超短脉冲的激光源的非常昂贵的技术。另外，在下述一 些情况中单光子激发优于多光子激发：其中，非线性光子破坏、荧光 探针的可用性、组织自发荧光背景和图像获取速度备受关注。