[发明专利]肉毒梭菌血清型A亚型中质粒编码的神经毒素基因

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年6月29日提交的美国临时申请号60/947,090的优先权，其全文出于所有目的通过引用纳入本文。

关于联邦资助研发的声明

不适用

发明领域

本发明涉及肉毒梭菌(Clostridium botulinum)血清型中分离的质粒编码的神经毒素基因。

发明背景

肉毒梭菌产生的肉毒神经毒素(BoNT)是影响人和动物的衰弱性疾病肉毒梭菌中毒的致病因子。BoNT也可认为是生物恐怖(BT)制剂。例如，在2001年，肉毒梭菌因其可能用作BT试剂而名列A类选择制剂[1]。除了作为病原体和可能的BT制剂的重要性外，目前BoNT广泛用作药物以治疗各种神经元疾病。

肉毒梭菌产生7种可区分血清型的BoNT，称为A-G。这些血清型描述为BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C，等等。产生的BoNT是原始毒素复合物，其中神经毒素与以下无毒性组分相连：非血凝素(NTNH)、血凝素(HA)、其它未表征的蛋白质组分和核酸[2]。编码毒素复合物中的神经毒素和相关蛋白质组分的基因组织成簇，它们的位置和组成在不同血清型和菌株之间有所不同[3]。有关各种肉毒梭菌毒素的特性的进一步信息可参考Jankovic和Brin的文章，“新英格兰医学杂志”(The New England Journal of Medicine)，17期，1990，第1186-1194页；和Charles L.Hatheway在名为《肉毒神经毒素和破伤风毒素》(Botulinum Neurotoxin and Tetanus Toxin)的书中第1章的综述，L.L.Simpson编，加利福尼亚州圣迭戈学术出版社(Academic PressInc.of San Diego，Calif.)出版，1989，这些文献的内容通过引用纳入本文。

肉毒梭菌的神经毒性组分的分子量约为150千道尔顿(kD)，其由约50kD的多肽链(Lc)和约100kD的较大多肽链(Hc)构成，据信Lc负责毒素的毒性(即，通过干扰乙酰胆碱的胞吐作用，降低乙酰胆碱释放的频率)，而Hc是毒素结合突触前膜并进入神经元所需。据信，肉毒梭菌血清型A、B、E和F的神经毒素基因簇位于染色体上，而肉毒梭菌血清型C1和D的神经毒素基因簇由噬菌体携带[4]。在肉毒梭菌BoNT/G中，神经毒素基因(cntA/G)显示位于约114kb的大质粒上[5]。

近来，鉴定了4种BoNT/A血清型(A1-A4)[6、7、8]。虽然BoNT/A亚型显示高度序列保守性，但底物识别和受体结合区域的差异足以明显影响有效疫苗和对策的开发[6、8]，以及可能影响药物活性。现已观察到即使在同一亚型内部，不同的A型菌株产生不同量的BoNT[9]。例如，实验测定到肉毒梭菌A3亚型菌株Loch Maree和A4亚型菌株657Ba产生的BoNT远少于大多数A1和A2亚型菌株。令人感兴趣的是，双神经毒素菌株657Ba主要产生BoNT/B，BoNT/A的产量甚至低于Loch Maree菌株。这些蛋白质的基础分子生物学和结构研究以及商品化和治疗性应用需要充足量的这些蛋白质，而该情况使其纯化更加复杂。

BoNT的治疗性应用包括需要反复给予BoNT-复合物的张力障碍、慢性面痛、斜视、慢性头痛、痉挛性肌肉疾病和其它慢性病。包含BoNT-复合物(即，不同于纯化的神经毒素)的市售可得药物，即，阿乐冈公司(Allergan，Inc.)的BOTOX是血清型A1。血清型B也有产品投入市场，例如索斯蒂斯公司(Solstice，Inc.)的NEUROBLOC或MYOBLOC，但其主要在血清型A之后次要使用，因为治疗需要大量单位并且与血清型A相比其作用持续时间较短，与其它6种血清型BoNT相比，血清型A的作用持续时间最长。虽然血清型A是目前主要批准的BoNT类型，但其具有免疫原性，意味着反复使用后人会对其耐受。因此，需要反复使用后不被存在的抗BoNA/A1的抗体中和的BoNT/A亚型，其分离和纯化来源以及获得和使用所述BoNT/A亚型的方法。

发明概述