[发明专利]包含来自细胞系产生的流感病毒的红血球凝聚素的病毒颗粒、组合物、制造方法和它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学和疫苗学领域。具体地，本发明涉及改进的病毒 颗粒、包含所述病毒颗粒的组合物和它们的应用。

背景技术

医疗的一个极为重要的目标是用于预防的现代疫苗的开发和用于疾 病治疗的治疗物质的有效递送。迄今为止，病毒颗粒是已知的适用于抗 原递送的囊泡和/或治疗物质的载体。

病毒颗粒是由脂质和至少一种病毒包膜蛋白组成的复合体，由体外 过程制备。脂质是从卵或植物中提纯，或者合成制造，一小部分的脂质 源于提供包膜蛋白的病毒。本质上，病毒颗粒表示再生的、空的病毒包 膜，所述病毒包膜缺乏包含源病毒遗传物质的核壳体。病毒颗粒不能复 制，而是纯的融合活性囊泡。这些病毒颗粒的功能体现在它们的膜融合 活性与完整病毒的明确的低pH依赖型膜融合活性极为相似，这是由病毒 融合蛋白单独介导。如同病毒，病毒颗粒通过受体介导的内吞作用或与 细胞膜融合而快速地被内在化。

通常，使用的病毒颗粒是被称作为免疫增强重组流感病毒颗粒 (IRIVs)。IRIVs是球形的、单层囊泡，其平均直径是150nm，包括双层 脂质膜，主要由磷脂组成，优选地是磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺 (PE)。IRIVs包含插在磷脂双分子膜中的所述功能型病毒包膜糖蛋白红血 球凝聚素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)。所述生物活性的HA不仅赋予 病毒颗粒制剂(formulation)的结构稳定性和同质性，还通过维持病毒融 合活性显著影响了免疫特性。任选地，所述IRIVs包括多于一种病毒株 的红血球凝聚素分子，因此形成了融合的IRIVs。

已通过将A型流感病毒株的红血球凝聚素(HA)合并至卵磷脂组成 的脂质体中开发IRIVs。流感病毒表面糖蛋白HA明确地指导病毒颗粒至 抗原呈递细胞，并导致和它们的内体膜(endosomal membrane)融合。这 一过程提供了抗原至免疫活性细胞的最佳处理和说明。T淋巴细胞被激活 产生细胞因子，从而刺激B淋巴细胞形成大量特异性抗体。而且，与抗 原-病毒颗粒复合体的直接接触也使对B淋巴细胞的刺激作用发生。

病毒颗粒在现代疫苗接种/治疗中是高效的佐剂/载体系统，具有作为 抗原递送囊泡的出色特性和强大的免疫原潜质，同时伴随地使副作用风 险最小。此外，病毒颗粒显示了佐剂(WO92/19267)，反式佐剂(trans -adjuvant)(欧洲专利申请EP05027624)和非特异性免疫刺激效果(欧洲 专利申请EP06027120)。

在50多年中，流感病毒疫苗在胚胎的鸡卵中培养。但是，传统的标 准方法非常冗长和麻烦。当前的卵源疫苗的生产，从新确定的病毒株的 分离到最终的产品，需要上至9个月。这可能妨碍对未曾预料的要求的 回应，如大流行(pandemic)株的发现、产品失败和季节性流行性感冒 病毒的变异。而且，传统的卵基的(egg-based)方法需要大量的卵，病 毒分离对卵的适应和大量的纯化以减少污染的卵蛋白的量和将卵蛋白致 敏症的风险降到最小。

相反地，基于细胞系的方法对于病毒的繁殖更快并且更加灵活，并 且可以允许在卵中不能充分生长的株的生产(如，1997年香港禽流感)。 而且，细胞系用来制造病毒有几个与生成的疫苗的安全性有关的优势： 在疫苗制剂中不存在抗生素添加剂，不需要有毒的防腐剂(例如硫柳汞)； 内毒素水平降低；不会引起卵致敏症；在无蛋白和血清的培养基中生长 (无外源因子/BSE)；病毒疫苗产品是高纯度的。

最近，相当大的努力用来开发细胞培养系统用于疫苗生产。多数已 知的细胞培养体系是基于哺乳动物细胞系，例如：Vero细胞，MDCK细 胞，BHK细胞和PerC6细胞。已经有许多关于基于哺乳动物细胞培养体 系的疫苗开发的报道。但是，在所述哺乳细胞培养体系生产的病毒疫苗 遭受对哺乳动物细胞源的蛋白的自体免疫反应的风险。

病毒颗粒融合过程对有效的抗原/药物递送是必要的(Schoen P等， 1999)。因此，本领域需要开发在融合活性和免疫原性具有改进性质的病 毒颗粒。

发明内容

本发明通过提供包含来自鸟细胞系产生的流感病毒的红血球凝聚素 (HA)的新的病毒颗粒满足了这个需要。相对于包含源于以标准程序用 鸡卵生产的流感病毒的红血球凝聚素的病毒颗粒，这些新的病毒颗粒的 特性在于改进的融合活性和改进的免疫原性。