[发明专利]根据粘弹性性质分离生物对象的方法

说明书

本发明涉及一种在具有不同粘弹性性质的溶液中分离生物对象的方法，其中所述方法包括允许较高粘弹性生物对象通过膜而同时保留较低粘弹性生物对象在膜以上的过滤步骤，和回收步骤，其中在膜以上或膜上回收分离的较低粘弹性生物对象和/或在过滤液中回收分离的较高粘弹性生物对象。有利地，生物对象是细胞。更有利地，回收的细胞是活细胞。在优选的具体实施方式中，细胞是肿瘤细胞。在另一个优选的具体实施方式中，细胞是胎儿细胞并且该方法用于产前的诊断。

经常需要为了异常和疾病的征兆而检查生物样品和标本。

作为一个例子，为了癌症的指征可能需要检查血液样品或脊髓液样品中的细胞。因为这类样品可能含有数百万的细胞，非常有利的是分离不感兴趣的大多数细胞和液体，从而浓缩感兴趣的细胞。

在血液和脊髓液中需要除去血浆、红细胞红血液细胞和白细胞(白血液细胞)，从而浓缩小量的不是正常存在和可能显示异常征兆如癌症的细胞。因为白细胞经常与感兴趣的细胞非常相似，难以不损失而除去这些细胞。然后产生的浓缩的感兴趣的细胞用于进一步分析。

现在可用的用于分离细胞类型的方法包括通过尺寸分离、通过离心分离(密度/比重)和根据化学或生物化学性质的分类。

当两类细胞非常不同时，通过离心分离作用得很好，如分离白血液细胞和红血液细胞的例子中。但是当两类细胞具有相似的密度和尺寸时，如白血液细胞和癌细胞，离心不起作用。基于离心的细胞分离的进一步局限是细胞的密度不是恒定的，因为甚至死细胞都与其外界和环境的条件反应。

使用通过抗体结合细胞至表面抗原的基于免疫的化学通过(生物)化学性质而分离是昂贵、费力和耗时的。许多步骤可以使细胞丢失因此减少了这类方法的分离效率。另外，如果细胞没有匹配的抗原，和/或如果抗原被其他血成分所遮掩细胞将丢失。血浆蛋白可以包被循环中的细胞(一种可能的癌细胞逃避免疫系统的方法)因此防止了其被抗体所识别。通过该方法分离的细胞通常是难以用视觉检查结果的形式。

通常通过过滤膜或具有特异性孔尺寸的一系列一个或多个空心管的过滤而进行通过尺寸的分离。比孔大的细胞留在过滤膜的一侧同时小细胞通过过滤膜并在过滤膜的另一侧被收集。在该分离方法中，使用固定剂稳定细胞的膜，如使用甲醛。但是，固定剂的作用后细胞不再是活的，并且不能培养。另外，如果两类细胞具有重叠的尺寸分布(一类细胞的某些部分比另一类细胞的大而另一部分比其小)，然后过滤膜不能有效地分离两类细胞，造成一些感兴趣的细胞的丢失，因此降低分离效率。

因此，通过上面方法的分离可以从生物化学上和机械性破坏细胞，因此改变细胞的形态，并抑制随后的处理和分析。

因此需要一种方法，其允许分离可能具有相同尺寸或重叠尺寸分布的不同的生物对象，并且有利地其不使所述生物对象变性，以便于在细胞的情况下，分离的细胞是活的并可以进一步培养。

本发明人制作了一种新的适应本领域需要的分离方法。根据本方法，根据其不同的生物性质分离生物对象，即使尺寸是相同的或重叠的。另外，该方法允许有利地回收进一步用于培养应用的生物对象。

因此本发明涉及一种通过对象类型分离对象的方法，其中，不同的对象类型不能完全通过尺寸、形状和密度(白细胞和某些癌细胞是两个重要的例子)而区分。该方法还提供高的分离效率，其允许使用较小的样品尺寸，具有较小的丢失感兴趣对象的风险。另外，不从生物化学上和形态上破坏感兴趣的对象，该方法不干扰随后的处理和分离，并保留所产生对象的正确形态。不使用感兴趣对象的化学/生物化学制备(所有这样的已知制备本质上修饰这样对象的生物化学和/或生物物理和形态性质)。然后分离的对象可以容易地以病理学家优选的方法呈现在幻灯片上，或通过自动可视系统阅读，或保留在液体溶液中用于随后的处理。

因此，本发明的主题是一种分离溶液中多种天然生物对象的方法，其中所述生物对象由至少一种天然较低粘弹性生物对象类型和一种天然较高粘弹性生物对象类型组成，并且该天然较低粘弹性生物对象具有比天然较高粘弹性生物对象低的粘弹性性质，其中该天然较低粘弹性生物对象是循环胎儿细胞和肿瘤或癌细胞中的至少一种，该方法包括：

-溶液的过滤步骤，其中：

○膜是多孔的并且孔的直径在天然较低粘弹性生物对象的直径以下并且也在部分天然较高粘弹性生物对象的直径以下，并允许天然较高粘弹性生物对象通过膜而同时保留天然较低粘弹性生物对象在膜以上，并且

○应用控制性力量，使其保持在低于强迫天然较低粘弹性生物对象通过膜需要的预定力量，并高于或等于强迫天然较高粘弹性生物对象通过孔需要的预定力量，和