[发明专利]使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用细菌菌株生产高浓度番茄红素的方法，该菌株用含有参与番茄红素生物合成的蛋白的编码基因的载体进行转化。更详细来说，本发明涉及通过在特定条件下培养和发酵转化的大肠杆菌，生产率增加的番茄红素生产方法，该转化的大肠杆菌具有导入的载体，载体含有番茄红素生物合成所需的基因，其中载体通过合并下列新基因中的至少一个来制备：序列表中核苷酸序列1的crtE，核苷酸序列3的crtB，和核苷酸序列5的crtI。

背景技术

番茄红素具有化学结构1中显示的结构，可以1kg西红柿0.02g的产量获得。番茄红素造成了番茄、西瓜、葡萄等的红色，是极性非常低的脂溶性物质，并具有强抗氧化和抗癌效应。

[化学结构1]

下面是关于本技术领域现有研究的概述。在2000年，由底特律Carmanos癌症研究会(Carmanos Cancer institute)的Omer的团队报道了番茄红素抑制前列腺癌的转移(Omer Kucuk等，Cancer Epidemiology，10，861-869，2001)。番茄红素的专业制造商LycoRed和特拉维夫(TelAviv)Hasharon医院(Hasharon hospital)的过敏实验室证实，番茄红素在患有运动引发的哮喘的患者中具有缓解症状的效应(L Neuman等，Allergy，55，1184-1189)。根据芬兰Cuopio大学公共卫生研究所(Research Institute of Public Health of the University of Cuopio)进行的临床试验，番茄红素也显示出对于心肌病和动脉粥样硬化具有出色的防护效应(Tiina Rissanen等，Exp Biol Med(Maywood).，227，900-907，2002)。

由于类胡萝卜素的优越效应如以前所述得到了证明，因此对番茄红素的需求日益增长。番茄红素已经通过从天然来源直接提取或通过有机合成来生产，但是最近有研究积极地利用微生物对其进行生产。具体来说，有两种类型的方法涉及培养和发酵微生物来生产番茄红素：(1)包括将番茄红素生物合成所需的基因导入不产生番茄红素的细菌菌株的方法，(2)包括将产生番茄红素作为生物合成类胡萝卜素例如胡萝卜素或虾青素的中间代谢产物的细菌菌株的番茄红素环化酶失活的方法。

番茄红素生物合成的过程显示在图1中。

通过代谢途径例如2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(在后文中称为MEP途径)或甲羟戊酸途径(在后文中称为MVA途径)，葡萄糖或甘油被转化成异戊烯基焦磷酸(在后文中称为IPP)或二甲基烯丙基焦磷酸(在后文中称为DMAPP)。本发明采用了MVA途径来生物合成IPP。通过MVA途径，源自于葡萄糖或甘油的甘油醛-3-磷酸被转化成乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，它然后经历一系列转化，成为乙酰乙酰辅酶A、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(在后文中称为HMG-CoA)、甲羟戊酸、甲羟戊酸-5-磷酸、甲羟戊酸-5-二磷酸，并最终成为IPP。编码该过程所需的酶的基因是atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2和mvaD。这样合成的IPP经历了一系列转化，变成法呢基焦磷酸(在后文中称为FPP)，它是类异戊二烯途径的重要中间代谢产物。然后FPP被转化成香叶基香叶基焦磷酸(在后文中称为GGPP)，它然后转化成八氢番茄红素，然后最终转化成番茄红素。编码参与该过程的酶的基因是crtE、crtB和crtI。

如上所述，作为类胡萝卜素共同前体的IPP的生物合成途径，已经知道有甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径，并且已知甲羟戊酸途径存在于大多数真核生物(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、植物细胞的细胞质、一些细菌(例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和Paracoccus zeaxanthinifaciens)以及疟疾细胞中。非甲羟戊酸途径存在于大多数细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、以及植物细胞的质体中。因此，革兰氏阴性细菌大肠杆菌只通过非甲羟戊酸途径生物合成IPP。但是，野生型大肠杆菌不具有类胡萝卜素例如番茄红素的生物合成所需的基因，因此不能生产番茄红素。