[发明专利]聚合酶稳定

说明书

发明背景

本公开内容涉及热稳定DNA聚合酶，包含热稳定DNA聚合酶的组 合物和试剂盒，以及用于分离和使用热稳定DNA聚合酶的方法。

DNA聚合酶是催化模板指导的DNA由脱氧核糖核苷酸三磷酸合成 的酶。一般地，DNA聚合酶(例如在微生物中的DNA聚合酶I、II和 III，在动物细胞中的DNA聚合酶α、β或γ)指导从DNA模板合成DNA 链，然而，一些DNA聚合酶(一般称为“逆转录酶”)指导从RNA模板 合成DNA链。一般地，这些通过IUPAC-IUBMB联合生化命名委员会 (Joint Commission on Biochemical Nomenclature) (www.chem.qmul.ac.ulliupac/jcbn/)在酶委员会编号EC.2.7.7.7和 EC.2.7.7.49下识别。已对来自各种生物包括细菌、酵母和人的DNA聚 合酶的分离和表征进行了广泛研究，特别是用于在体外反应中使用。

当选择DNA聚合酶用于特别在体外反应中使用时，技术人员必须 考虑许多变量。例如，可以选择DNA聚合酶，以使其天然5′-3′或3′-5′ 外切核酸酶活性缺失(例如通过诱变或通过翻译后修饰例如酶促消化)， 以显示低错误率，以显示高持续合成能力和延伸率，和/或以显示有利的 热稳定性。来自嗜热微生物的DNA聚合酶的鉴定，和热稳定DNA聚合 酶在诸如PCR的方法中的使用已导致鉴定且处理DNA的能力中的革 命。已从嗜热真细菌、嗜热古细菌等中分离了许多热稳定DNA聚合酶。

热稳定DNA聚合酶的例子包括但不限于衍生自水生栖热菌 (Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶(参见例如美国专利号 4,889,818)；衍生自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的Tth DNA 聚合酶(参见例如美国专利号5,192,674；5,242,818；5,413,926)；衍 生自栖热菌属(Thermus)物种spsl 7，现在称为Thermus oshimai的Tsp spsl 7 DNA聚合酶(参见例如美国专利号5,405,774)；衍生自激烈火球 菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu DNA聚合酶(美国专利号5,948,663)； 衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的Bst DNA聚 合酶(美国专利号5,747,298)；衍生自Thermococcus litoralis的Tli DNA 聚合酶(美国专利号5,322,785)；衍生自火球菌属物种(Pyrococcus sp.) KOD1的KOD DNA聚合酶(美国专利号6,033,859)；衍生自 Thermococcus barosii的nTba和Tba DNA聚合酶(美国专利号5,602,011 和5,882,904)；以及商购可得的DNA聚合酶例如Thermo Sequenase^TM(Amersham)和AmpliTaq^TM(Applied Biosystems，Tabor，S& Richardson，C.C.(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，6339-6343)。

去污剂已在本领域中用于稳定膜，以增强各种化学试剂的透化作 用，并且用于破坏细菌细胞壁，从而促进来自微生物的细胞内蛋白质例 如DNA聚合酶制备。Goldstein等人公开了制备基本上不含核酸的热稳 定酶的方法(美国专利号5,861,295)。Gelfand等人公开了在包含一种 或多种非离子型聚合去污剂的缓冲液中包括纯化的、稳定的热稳定聚合 酶的稳定酶组合物(美国专利号6,127,155)。Simpson等人，Biochem.Cell. Biol.68：1292-6(1990)公开了通过添加剂例如Triton X-100稳定的 DNA聚合酶的纯化。

去污剂可以难以从所得到的纯化种类中完全去除。此外，在酶促反 应中，例如DNA测序反应中，去污剂的存在可能影响结果。参见例如， Ruiz-Martinez等人，Anal.Chem.70：1516-1527，1998。此外，在不存 在去污剂的情况下，一些热稳定的DNA聚合酶可能随着时间过去相当 大地减少活性。参见例如美国专利号6,127,155，其公开了在非离子型聚 合去污剂中的热稳定DNA聚合酶。Tween 20是公开的一种具体去污剂。