[发明专利]用于体内递送至哺乳动物细胞的、包含无质粒的功能性核酸的、源自细菌的完整小细胞

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2007年3月30日提交的、申请号为60/909070的美国临时申请的 优先权，前述申请在此通过引用全部并入本文。

背景技术

最近，许多基于核酸的策略已被开发出来用于调节多种细胞功能 (Opalinska和Gewirtz，2002)。各种寡核苷酸，例如：适配体、转录因子结合 诱杀寡核苷酸、核酶、三链结构寡核苷酸、免疫刺激CpG模体、反义寡核苷酸 (包括肽核酸)、小干扰RNA和微RNA，因为它们的高度特异性的作用模式 而作为研究工具已吸引了很多注意力。这些寡聚核酸作为治疗剂也具有相当 大的潜能。但是，这样的治疗剂面临几个障碍，包括游离核酸的不稳定性以 及这些大分子的安全、有效和靶向的细胞递送(Dykxhoorn和Lieberman，2005)。

许多基于核酸的治疗策略的焦点是RNA干扰(RNAi)现象，通过RNAi 细胞中长的、双链RNA(dsRNA)导致同源的(互补的或部分互补的)基因 转录体的序列特异性降解。更具体而言，长的dsRNA分子通过被称为“切酶” 的内源性核糖核酸酶加工成较小的RNA(Grishok等，2000，Zamore等，2000)。 当该较小的RNA来自于外源性源时，它们被称作“短干扰RNA”(siRNA)，而 当该较小的RNA由细胞自身基因组中的RNA编码基因产生时，它们被称作“微 RNA”(miRNA)。这两类小的(通常为21至23个核苷酸)调节性RNA的区别 还在于，miRNA与信使RNA(mRNA)靶标仅部分互补。

短的调节性RNA结合至具有解旋酶活性和核酸内切酶活性的所谓的 “RNA诱导性沉默复合物”(RISC)。解旋酶活性解开双链RNA分子，使得反 义链可结合至靶标RNA分子(Zamore等，2000；Zamore，2002；Vickers等， 2003)。核酸内切酶活性在反义链结合的位置水解靶标RNA。

因此，在RNAi中，单链RNA分子(ssRNA)通过Watson-Crick碱基配对 原则结合至靶标RNA分子并征集降解靶标RNA的核糖核酸酶。相反，基因表 达的反义抑制使得ssRNA结合至mRNA，阻断翻译，而不催化mRNA的降解。

通常，调节性RNA在人类血浆中具有小于一个小时的半衰期(Layzer等， 2004)并且通过肾被快速地排泄掉。因此，几个研究团体已尝试制备包括siRNA 在内的抗核酸酶的调节性RNA。这样的努力的例子包括化学修饰核苷酸(例 如，2’-F、2’-OMe、锁定核酸；LNA)或磷酸二酯骨架，例如磷酸二酯键(Chiu 和Rana2003；Choung等，2006；Czauderna等，2003；Elmen等，2005；Layzer 等，2004；Morrissey等，2005)。此外，为使得siRNA或其他调节性RNA在 循环中花费的时间最小化，操作人员已将RNA分子接合至蛋白质和抗体，以 靶定所期望的哺乳动物细胞。在解决低稳定性和快速肾排泄问题的进一步努 力中，操作人员已开发出用于递送调节性RNA的载体。多聚复合物(由核酸 与聚阳离子的自组装形成)、脂多聚复合物(通过首先缩合核酸与聚阳离子， 随后添加阳离子脂类而形成)、脂质体和合成纳米颗粒也在开发当中。

这些方法也面临许多障碍，例如：(a)载体蛋白通过肾排泄而从血清中 快速清除，(b)少数可接合至每个载体蛋白的调节性RNA分子，(c)完整 的调节性RNA难以与载体蛋白细胞内脱离，(d)由可用作调理素的多聚复合 物结合血清蛋白导致的快速清除(Dash等，1999)，和(e)脂质体在体内的 不稳定性，导致核酸释放进入血清和潜在的非特异性转化。

病毒载体也已被开发用来内源性地产生调节性RNA。参见，例如，Devroe 和Silver，2004。但是，这些病毒载体具有严重的安全顾虑。例证性的问题包 括与野生型病毒的重组、插入潜能和致癌潜能、病毒诱导的免疫抑制、病毒 载体携带DNA大片段的有限能力、复原至减毒病毒的毒力、难以制造和销售、 低稳定性和有害反应(Hacein-Bey-Abina等，2003；Kootstra和Verma，2003； Raper等，2003；Verma和Weitzman，2005；Check，2005)。