[发明专利]从植物基因组中切除核酸序列的方法

权利要求书

1.用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的方法，所述方法包括：

a)用编码DNA双链断裂诱导酶的构建体转化植物细胞，

b)从步骤a)的细胞产生转基因植物品系，

c)用步骤b)的植物品系或其细胞或部分实施瞬时测试法以分析该转基因DNA双链断裂诱导酶的功能性，

d)将步骤b)的植物品系与含有待切除核酸序列的植物品系杂交，其中待切除的核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两侧邻接允许DNA修复机制的重复序列，和

e)进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。

2.用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的方法，所述方法包括：

a)用编码待切除核酸序列的构建体转化植物细胞，其中待切除的核酸序列包含对DNA双链断裂诱导酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两侧邻接允许DNA修复机制的重复序列，

b)从步骤a)的细胞产生转基因植物品系，

c)用步骤b)的植物品系或其细胞或部分实施瞬时测试法以分析步骤a)的构建体的识别序列和重复序列的功能性，

d)将步骤b)的植物品系与含有DNA双链断裂诱导酶的植物品系杂交，和

e)进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。

3.根据权利要求1或2的方法，其中DNA修复机制是同源重组。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤b)或c)之后鉴定单拷贝转基因品系。

5.根据权利要求4的方法，其中单拷贝转基因品系的鉴定通过包括定量PCR或Southern杂交在内的分子技术进行。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤b)或c)之后分析转基因表达水平。

7.根据权利要求6的方法，其中转基因表达水平的分析通过包括RT-PCR或Northern杂交在内的分子技术进行。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤b)或c)之后对转基因植物品系授粉，其中所述授粉是自花授粉或与野生型品系异花授粉。

9.根据权利要求8的方法，其中对通过授粉所获得的种子和/或籽苗分析它们的接合性。

10.根据权利要求9的方法，其中选择在接合性分析后鉴定的纯合品系用于步骤d)的杂交。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的转化选自农杆菌介导的转化、生物射弹转化、原生质体转化、聚乙二醇转化、电穿孔、超声处理、微量注射、大量注射、真空抽滤、感染和在含DNA的溶液中孵育干燥胚。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的瞬时测试法是染色体内同源重组测定法。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的瞬时测试法包括报告构建体的瞬时转化。

14.根据权利要求13的方法，直到它引用权利要求1或从属权利要求为止，其中报告构建体选自GUS构建体、绿色荧光蛋白构建体、氯霉素转移酶构建体、萤光素酶构建体、β-半乳糖苷酶构建体、R-基因座基因产物构建体、β-内酰胺酶构建体、xyl E基因产物构建体和α淀粉酶构建体、酪氨酸酶构建体和水母发光蛋白构建体。

15.根据权利要求13或14的方法，直到它们引用权利要求1或从属权利要求为止，其中报告构建体包含待切除的核酸序列，其中该核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中该核酸序列在两个末端邻接允许DNA修复机制的重复序列，所述的DNA修复机制包括同源重组。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对通过步骤e)所获得的种子和/或籽苗分析包括同源重组在内的DNA双链断裂介导的修复机制。

17.根据权利要求16的方法，其中分析种子和/或籽苗中包括同源重组在内的DNA修复机制是通过包括PCR分析法、比色或生物化学测定法或者DNA测序法在内的分子技术确定的。