[发明专利]修饰的磷酸酶

说明书

技术领域

本发明涉及磷酸酶，且更具体地涉及(遗传)修饰的磷酸酶、包含(遗 传)修饰的磷酸酶的药物组合物、和(遗传)修饰的磷酸酶在治疗或治愈如 败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、或肾衰竭中的用途。本发明还涉及制 备磷酸酶的方法。

背景技术

磷酸酶是对其底物进行去磷酸化的酶；即其将磷酸单酯水解为磷酸根离 子和具有自由羟基基团的分子。此作用与通过使用能量分子如ATP将磷酸 根基团连接到其底物上的磷酸化酶和激酶的作用直接相反。磷酸酶可以被分 为主要的两类：半胱氨酸依赖性磷酸酶(CDP)和金属磷酸酶。后者的活性 依赖于在其活性位点上一种或多种金属离子的存在。

CDP通过磷酸-半胱氨酸中间产物催化磷酸酯键的水解。游离的半胱氨 酸亲核试剂与磷酸根部分的磷原子成键，并通过合适位置的酸性氨基酸残基 或水分子将连接磷酸根基团和酪氨酸的P-O键质子化。磷酸-半胱氨酸中间 产物随后被另一水分子水解，由此产生用于另一去磷酸化反应的活性位点。

金属磷酸酶与其活性位点内的一个或多个催化必需的金属离子配位。目 前对这些金属离子的鉴定存在一些混乱，原因是不断尝试去鉴定它们但得出 了不同的答案。目前证据表明这些金属可能是镁、锰、铁、锌或其任意组合。 认为桥接两金属离子的氢氧根离子参与了对磷酸根基团的亲核攻击。

磷酸酶发挥与将磷酸根基团添加到蛋白质上的激酶/磷酸化酶相反的作 用。磷酸根基团的添加可以活化或去活化酶(如激酶信号通路)，或使蛋白 质-蛋白质相互作用发生(如SH3结构域)；因此磷酸酶是许多信号转导通 路所必需的。应该注意到磷酸根的添加和去除并非必需对应酶的活化或抑 制，且一些酶具有用于活化或抑制功能性调节的单独磷酸化位点。例如，CDK 的活化或去活化依赖于被磷酸化的特定氨基酸残基。磷酸根在信号转导中很 重要，因为它们调节与其相连的蛋白质。将磷酸根去除以逆转该调节作用。 这可以通过水解自行发生，或受蛋白质磷酸酶的调节。

并非限制本发明，将碱性磷酸酶作为本文所述和要求保护的磷酸酶的实 例进行详细讨论。碱性磷酸酶(ALP)(EC3.1.3.1)是负责从包括核苷酸、 蛋白质和生物碱的多种分子中去除磷酸根基团的水解酶。去除磷酸根基团的 过程被称为去磷酸化。顾名思义，碱性磷酸酶在碱性环境下最有效。

因为DNA通常在5’端具有磷酸根基团，所以碱性磷酸酶已成为分子生 物学实验室中一种十分有用的工具。去除这些磷酸根防止了DNA的连接(5’ 端连接相同或另一分子的3’端)；此外，磷酸根基团的去除使得可以进行放 射标记(被放射活性磷酸根基团替代)，以通过方法或实验中的其它步骤测 定被标记DNA的存在。出于这些目的，来自虾的碱性磷酸酶最有用，因为 其一旦完成其使命则最易被去活化。

碱性磷酸酶的另一重要用途是作为酶免疫分析的标记物。

此外，碱性磷酸酶可以用在如败血症、炎性肠疾病或肾衰竭的治疗中。

虽然现有的(碱性)磷酸酶在诊断学和疾病治疗中都十分有用，但是仍 需具有如改变的(如改进的)比活性、稳定性(如体内T_1/2、或储存(货架 期)方面的稳定性)或底物特异性的备选磷酸酶。此外，也需要具有不同的 pH或温度或盐依赖性分布，或不依赖pH或温度或盐的磷酸酶。

发明内容

本发明提供了备选的(遗传)修饰的磷酸酶。

在第一实施方案中，本发明提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离 或重组的碱性磷酸酶，其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的 碱性磷酸酶。这些突变体在本文中也称为“结构域交换突变体”。

碱性磷酸酶(AP)(根据IUBMB酶命名法为EC3.1.3.1，常用名为碱 性磷酸酶)是催化磷酸单酯(phosphatase monoester)和H₂O反应生成醇和 磷酸根的酶。AP的其它名称为碱性磷酸单酯酶、磷酸单酯酶、甘油磷酸酶、 碱性磷酸水解酶、碱性苯基磷酸酶、正磷酸单酯磷酸水解酶(最适宜碱性)。 AP的系统名称为磷酸单酯磷酸水解酶(最适宜碱性)。