[发明专利]用于制造重组多克隆蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明是关于使用不依赖位点特异性整合的生产系统 产生重组多克隆蛋白质，诸如来自免疫球蛋白超家族的蛋白 质，例如可溶形式或膜结合形式的B细胞受体或T细胞受 体。

背景技术

诸如传染病及癌症的许多疾病缺乏有效疗法。单克隆抗 体一般尚未成功对抗所有此等靶标，此部分归因于复杂靶标 的变异性及引起自单克隆抗体识别免疫逃脱的靶蛋白质适 应性突变。另一方面，多克隆抗体能靶向多个动态靶标，例 如病毒、细菌或癌细胞。又，多克隆抗体在抗原突变情况下 具有保留活性的最高可能性。

存在不同市售多克隆抗体治疗剂，包括：1)自正常人 类供体的血液分离的正常人类免疫球蛋白；2)来源于带有 针对特定疾病靶标(例如病毒)的抗体(先前已经由感染或 接种而遇到)的个别人类供体的血液的人类高免疫性免疫球 蛋白；及3)来源于经免疫动物的血液的动物高免疫性免疫 球蛋白。

自人类血液纯化的免疫球蛋白已证实有效对抗B型肝 炎病毒、呼吸道合胞病毒、细胞巨大病毒及其它疱疹病毒、 狂犬病病毒、肉毒杆菌毒素等感染，以及有效预防新生恒河 猴D(neonatal rhesus D)。自用人类T细胞免疫的兔血液 纯化的免疫球蛋白被用于在治疗或预防移植排斥反应中提 供T细胞免疫抑制(例如抗胸腺细胞球蛋白(Thymoglobulin ))。正常人类免疫球蛋白已被用于加强免疫缺陷患者的免 疫系统以及用在各种自体免疫病症的疗法中。

然而，广泛使用免疫球蛋白因供体血液原料的供应受 限、批次间变化的问题及安全性不稳定而已受限制。动物源 性免疫球蛋白尤其面临20世纪80年代及90年代对于动物 源性单克隆抗体所观测相同的免疫原性问题。最后，如同其 它血液产品一样，诸如HIV、疱疹或肝炎病毒或病毒性蛋白 颗粒的感染剂传播的危险仍存在。因此，尽管临床医师承认 多克隆抗体在一些情况下为优选治疗剂，但其使用已极受限 制。

产生人类免疫球蛋白的新方法随转基因动物技术而出 现。已产生带有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠(美国 专利第6,111,166号)。此等小鼠产生完全人类免疫球蛋白， 且针对特定靶标的抗体可藉由常用免疫技术产生。然而，较 大抗体产量因相对小体型的小鼠而受限。亦已将较大型动物 制成人类免疫球蛋白基因转基因动物，例如牛(Kuroiwa，Y. 等人Nature Biotechnology；2002；20：889-893)。然而，自 该等动物的血液产生供治疗用的多克隆抗体并非无并发症 问题。首先，动物及人类的免疫生理学可能显示相当大的差 异，引起所得免疫库、功能重排及抗体反应多样性的差异。 第二，所引入的免疫球蛋白基因座的有丝分裂不稳定性可能 影响抗体的长期产生。第三，删除动物自身免疫球蛋白基因 座使得(例如)动物抗体的产生将不超过人类抗体产生在技 术上具挑战性。第四，诸如病毒、朊病毒或其它病原体的感 染剂传播的危险伴随动物中所产生的人类抗体的给药。

最近，已开发出在产生时不依赖供体可用性的一种新型 多克隆抗体。此等多克隆抗体是藉由自具有针对所要靶标的 免疫反应的供体分离编码抗体的核酸序列、接着筛选出特异 性结合所要靶标的抗体而产生。多克隆抗体可藉由经修改的 哺乳动物表达技术来制造，该技术是基于如WO 2004/061104中所述一个抗体表达质粒位点特异性整合至各 细胞的同一基因组位点中。此新型多克隆抗体的一实例为针 对恒河猴D的重组多克隆抗体(WO 2006/007850)。使用 位点特异性整合产生细胞群体，其中各细胞含有单一拷贝且 其中表达水平及生长速率预期为相对均一的。

发明概要

本发明提供用于产生重组多克隆蛋白质的替代方法，该 等方法不依赖位点特异性整合且由此关于产生细胞系的选 择提供增加的灵活性，同时维持蛋白质的多克隆性。另外， 表达水平可高于使用位点特异性整合的可能表达水平。

本发明的方法是基于所关注的个别基因随机整合至宿 主细胞中，优选接着克隆具有所要特征的单细胞。接着将各 自产生多克隆蛋白质的个别成员的个别细胞克隆混合以产 生用于产生多克隆蛋白质的多克隆制造细胞系。