[发明专利]用于利用纳米孔进行分子检测的设备和方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测分子(例如聚合物分子)的设备和方法。 本发明具体涉及纳米孔分子检测器，例如用于检测DNA核苷酸单体的 纳米孔分子检测器。

背景技术

DNA是由两条分子链组成的双螺旋结构。每条链形成为腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)四个核苷酸的一 个链条。这些核苷酸的顺序或序列编码了针对任何活体内新陈代谢和 繁殖的所有信息。人类的DNA中每条链由超过30亿个核苷酸构成。

了解物种的DNA序列，从基础科研角度看是有趣的，而且还提 供了医药方面的许多可能性，比如疾病的早期检测以及新疫苗和药物 的开发。对个体的DNA指纹检测已经成为犯罪学的标准技术。由于这 么多的应用，因此DNA测序，即确定在一条DNA链中的核苷酸顺序， 已经成为设备制造商和服务提供商的巨大市场。

链终止方法(由F.Sanger开发)是用于DNA测序的尖端技术。 近来已经提出了两种新技术，“焦磷酸测序(pyrosequencing)”和 “454测序”(缘于454公司)。虽然在样本制备和检测方面有显著 差异(链终止使用用于DNA片段分离的电泳以及染料或放射性标签， 而焦磷酸测序和454测序则基于复制过程中核苷酸结合到DNA链中时 的化学发光酶反应)，但所有技术都依靠通过聚合酶链反应(PCR) 来扩增DNA的初始量。并且，它们也在本身的测序过程中利用PCR。

因此，链终止、焦磷酸测序和454测序都受到PCR的局限性的 影响(例如，引物退火到第二位点，用作引物的RNA被污染，与DNA 的二级结构相关的读取问题)。由于这些以及其它制约，基于链终止 方法的测序机器可以检测最多大约1000个核苷酸，而454测序仅仅 可以检测100个左右的核苷酸。在基因组还不明确时，这对于整个基 因组尤其对于高度重复的基因组有严重的缺点。PCR由于在特定温度 下有循环步骤因此也是一种相对较慢的过程，并且需要大量(昂贵的) 化学品。

在大学和工厂中进行了大量的替代测序技术的研究，致力于不 依靠PCR。然而，迄今为止还没有一个研究得出良好的结果。

纳米孔测序是最受青睐的新技术之一，例如在 US20050102721(A1)和US20030104428(A1)中有描述。

通过电泳，将一个DNA分子“拉着”穿过一个直径为几纳米数 量级的细孔(在多数实验中使用固态孔，但已经研究出了脂质双层中 的跨膜蛋白质。

图1示出传统纳米孔测序的基本操作原理。

膜两侧的偏压导致离子流过包含离子的两种溶液之间的纳米孔 12。通过将DNA聚合物14拉过该纳米孔，通过的离子数量减小，这 可以检测为电流中的变化。

理论上，DNA一次通过该孔一个核苷酸，每个核苷酸以特有的方 式阻止电流通过该孔。电流读数的序列直接代表DNA序列。为了准确， 孔的直径必须非常小(大约为核苷酸的尺寸)以便单个核苷酸可以阻 止电流，并且足够细以确保信号由单个而不是多个核苷酸调制。

EP1486775(A1)公开了一种在孔的两端制造了两个电极的纳米 孔装置。随着DNA链被逐渐拉过该孔，序列信息在这些电极之间的隧 穿电流中传送。在图2中示出了这种装置。

类似地，EP1433744(A1)公开了一种埋置到基底中的纳米管，纳 米管具有穿过管和基底的纳米孔。当施加电压时，通过将DNA链拉过 孔并测量管的两部分之间的电流来对DNA测序。其结构在图3中示出。 在该构造中，施加了两个电压——一个在纳米管的左右侧之间用于获 得序列(例如穿过核苷酸的隧穿电流)，另一个平行于孔用以将DNA 链拉过孔。

这些器件除了制造方面困难很大以外(例如，如何将孔刻蚀掩 膜与图3中的纳米管对齐)，上述基于纳米孔的测序装置的最大缺点 之一是过大的敏感区域。一条DNA链中的两个相邻基之间的间距仅为 0.34nm。这表明用于检测单个核苷酸的探测器的尺寸必须是相同数量 级或者甚至更小。然而，厚度小于1nm的纳米孔难以生产，并且如材 料稳定性、绝缘性不足和过高的电容之类的许多其它问题制约了这些 装置。

如图2所示，电极距离典型地比基间隔大得多，导致信号成为 在孔中所有基上的平均。于是单个核苷酸检测是不可能的。在图3 中示出了该装置的相同应用。虽然纳米管可以具有非常细的直径，但 还没有达到相邻核苷酸的间距的这种程度。